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《葡萄品种资源叶片白腐病和灰霉病的抗病鉴定及评价》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
全日制农业硕士学位论文葡萄品种资源叶片白腐病和灰霉病的抗病鉴定及评价研究生：刘丽婷指导教师：赵玉辉讲师郭印山副教授合作指导教师：蔡之博高级农艺师申请学位类别：农业硕士专业领域名称：园艺研究方向：果树种质资源评价与利用所在学院：园艺学院2018年6月 DissertationforMaster’sDegreeIdentificationandEvaluationofResistancetoWhiteRotandBotrytiscinereaintheLeafofGrapeVarietalResourcesCandidate：LiuLitingSupervisor：ZhaoYuhuilecturerAssociateProf.GuoYinshanCooperationSupervisor:CaiZhiboSeniorAgronomistDegreeCateory:MasterofAgriculturalExtensionSpeciality:HorticultureResearchField:EvaluationandUtilizationofFruitTrees’GermplasmResourcesCollege:CollegeofHorticultureShenyangAgriculturalUniversityJune,2018 沈阳农业大学硕士学位论文目录摘要.........................................................1Abstract................................................................21前言...................................................................31.1葡萄抗病性及其研究进展............................................31.2葡萄白腐病的研究进展..............................................41.2.1葡萄白腐病起源与分布........................................41.2.2葡萄白腐病发病规律..........................................41.2.3葡萄白腐病症状表现..........................................51.2.4葡萄资源对白腐病的抗性进展..................................51.3葡萄灰霉病的研究进展..............................................51.3.1葡萄灰霉病起源与分布........................................51.3.2葡萄灰霉病发病规律..........................................61.3.3葡萄灰霉病症状表现..........................................61.3.4葡萄资源对灰霉病的抗性进展..................................61.4葡萄抗病结构的研究现状............................................71.5葡萄抗病性与生理指标的研究现状....................................81.6本研究的目的与意义................................................92葡萄品种资源抗病性鉴定.............................................102.1试验材料.........................................................102.2试验方法.........................................................132.2.1培养基配制及菌的扩繁.......................................132.2.2白腐病菌丝培养.............................................132.2.3灰霉病原菌孢子培养.........................................132.2.4葡萄品种资源的白腐病抗性鉴定...............................132.2.5葡萄品种资源的灰霉病抗性鉴定...............................142.2.6数据处理分析...............................................152.3结果与分析.......................................................152.3.1葡萄白腐病原菌培养结果.....................................152.3.2葡萄灰霉病原菌培养结果.....................................152.3.3葡萄品种资源的白腐病抗性鉴定结果...........................152.3.4葡萄品种资源的灰霉病抗性鉴定结果...........................182.3.5葡萄品种资源综合抗性结果分析...............................202.4讨论.............................................................213葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究...............................233.1试验材料.........................................................233.2试验方法.........................................................253.2.1葡萄叶片气孔显微观察.......................................253.2.2葡萄叶片横切面显微结构观察.................................25I 目录3.2.3葡萄叶片中过氧化氢酶(CAT)活性测定..........................253.2.4葡萄叶片中过氧化物酶(POD)活性测定..........................263.2.5数据处理分析...............................................263.3结果与分析.......................................................263.3.1葡萄叶片气孔结构相关数据分析...............................263.3.2葡萄叶片横切面观察及相关数据分析...........................273.3.3葡萄叶片受侵染后过氧化氢酶(CAT)活性的影响..................303.3.4葡萄叶片受侵染后过氧化物酶(POD)活性的影响..................333.4讨论.............................................................363.4.1葡萄抗病性与葡萄叶片显微结构的作用关系.....................363.4.2葡萄抗病性与酶活性（CAT/POD）的作用关系....................374结论..................................................................38参考文献...............................................................39附录....................................................................44致谢....................................................................46II 沈阳农业大学硕士学位论文CONTENTSAbstractinChinese.............................................................................................1AbstractinEnglish................................................................................................................21Introduction.............................................................................................................................31.1Grapediseaseresistanceanditsresearchprogress......................................................31.2Researchprogressofwhiterotingrape.......................................................................41.2.1Theoriginanddistributionofgrapewhiterot..................................................41.2.2Occurrenceregularityofgrapewhiterot..........................................................41.2.3Symptomsofgrapewhiterot............................................................................51.2.4Progressinresistanceofgraperesourcestowhiterot.......................................51.3ResearchprogressofgrapevineBotrytiscinerea.......................................................51.3.1TheoriginanddistributionofgrapevineBotrytiscinerea..............................51.3.2Incidenceofgrapebotrytis................................................................................61.3.3SymptomsofgrapeBotrytiscinerea...............................................................61.3.4ProgressinresistanceofgraperesourcestoBotrytiscinerea.........................61.4Researchstatusofdiseaseresistancestructureofgrape..............................................71.5Researchstatusofdiseaseresistanceandphysiologicalindexesofgrape...................81.6Thepurposeandsignificanceofthisstudy..................................................................92Identificationofdiseaseresistanceofgrapevariety...............................................102.1Experimentalmaterial................................................................................................102.2Experimentalmethod.................................................................................................132.2.1Preparationofculturemediumandpropagationofbacteria...........................132.2.2Myceliumcultureofwhiterot.........................................................................132.2.3Sporescultureofpathogenofaspergillus.......................................................132.2.4Identificationofresistancetowhiterotofgrapevarietyresources................132.2.5IdentificationofresistancetoBotrytiscinereaingrapevarietyresources.....142.2.6Dataprocessinganalysis.................................................................................152.3Resultsandanalysis...................................................................................................152.3.1Culturingresultsofgrapewhiterotpathogen.................................................152.3.2Culturingresultsofpathogenicbacteriaofgrapevineaspergillus..................152.3.3Identificationofresistancetowhiterotofgrapevarietyresources................152.3.4IdentificationresultsofBotrytiscinereaingrapevariety...............................182.3.5Analysisoncomprehensiveresistanceofgrapevarietyresources..................202.4Discussions.................................................................................................................213Studyondiseaseresistancemorphologyandphysiologyofgrapevarietyresources............................................................................................................................233.1Experimentaltmaterial.............................................................................................233.2Experimentalmethod.................................................................................................253.2.1Microscopicobservationofstomataingrapeleaves.......................................253.2.2Observationonmicrostructureofcrosssectionofgrapeleaf.........................253.2.3DeterminationofCATactivityingrapeleaves...............................................253.2.4DeterminationofPODactivityingrapeleaves...............................................263.2.5Dataprocessinganalysis.................................................................................263.3Resultsandanalysis...................................................................................................26III CONTENTS3.3.1Analysisofrelevantdataonstomatalstructureofgrapeleaves......................263.3.2Crosssectionobservationofgrapeleavesandanalysisofrelateddata..........273.3.3Theeffectofcatalase(CAT)activityafterInfestationofgrapeleaves...........303.3.4Theeffectofperoxidase(POD)activityafterInfestationofgrapeleaves......333.4Discussions.................................................................................................................363.4.1Relationshipbetweengrapediseaseresistanceandgrapeleafmicrostructure363.4.2Relationshipbetweengrapediseaseresistanceandenzymeactivity(CAT/POD)..................................................................................................................................374Conclusions.....................................................................................................................38References.............................................................................................................................39Appendixex...........................................................................................................................44Acknowledgements.............................................................................................................46IV 沈阳农业大学硕士学位论文摘要葡萄是世界范围内栽培面积较广泛的果树种类之一，葡萄的种植面积逐年扩大。病害一直是威胁葡萄生产的重要因素，葡萄白腐病和灰霉病分别导致欧亚种及欧美杂交种生产园减产高达25%-75%与20%-50%。目前，生产上对该类葡萄病害防治主要措施是药剂防治，但存在污染环境和食品安全等问题。本研究以101份葡萄品种为研究试材，进行白腐病及灰霉病的抗性鉴定，同时对其相关理化指标进行测定、并观察葡萄叶片的显微结构。研究结果为生产上筛选和栽培抗病品种提供参考依据，并为抗性新品种的选育提供更多的亲本选择。主要研究结果：（1）通过对101份不同葡萄品种进行叶片抗白腐病和灰霉病鉴定，可得出不同葡萄品种对白腐病与灰霉病的抗性差异明显。结果筛选出了高抗白腐病材料9份，分别为北冰红、双红、甜冬、双丰、双庆、双优、左红一、左山一和左优红。高抗灰霉病材料8份，分别为皇冠、双优、金星无核、康可、秦岭桑叶、着色香、高妻和火星无核，研究结果可作为选育抗病新品种的亲本，也为生产栽培选择品种提供依据。（2）对不同抗病类型的30份葡萄品种进行叶片显微结构观察。结果表明，白腐病抗性与气孔大小及海绵组织厚度存在显著性关系，灰霉病抗性仅与海绵组织厚度有关。（3）根据45份不同抗病类型葡萄品种的酶活性测定。得出葡萄品种抗性和CAT、POD活性呈正相关性，研究结果可作为葡萄品种白腐病和灰霉病抗性鉴定的辅助标准。关键词：葡萄品种，白腐病，灰霉病，抗性鉴定1 AbstractAbstractGrapeisoneofthemostwidelycultivatedfruitintheworld.Thediseasehasbeenanimportantfactorthreateningitsincreasingproduction.WhiterotofgrapeandBotrytiscinerearesultedinyieldofEuropeansubspeciesandEuropeanandAmericanhybridreductionby75%and50%respectively.Atpresent,themaincontrolmeasuresforthiskindofgrapediseasearepharmaceuticalcontrol,butthereareproblemssuchasenvironmentalpollutionandfoodsafety.,buttheeffectivenessisnotgood..101grapevarietieswereusedasexperimentalmaterialsinthisstudytoidentifytheresistanceofwhiterotandBotrytiscinerea.Inaddition,therelatedphysicochemicalindexesweredetermined,andthemicrostructureofgrapeleaveswasobserved.Theresultsprovidedareferenceforscreeningandcultivationofresistantvarietiesinproduction,aswellasmoreparentalselectionforthebreedingofnewresistantvarieties.Mainfindingsarefollowed:(1)TheidentificationofresistanceofwhiterotandBotrytiscinereain101differentgrapevarietiesrevealedthattheresistanceofwhiterotandBotrytiscinereawassignificantlydifferentindifferentgrapevarieties.Theresultsshowedthat9samplesofhighresistantwhiterotwerescreenedout,whichwereBeibinghong,Shuanghong,tiandong,Shuangfeng,Shuangqing,Shuangyou,Zuohongyi,ZuoshanyiandZuoyouhong.And8materialswithhighresistanceofBotrytiscinereawereHuangguan,Shuangyou,VenusSeedless,Concord,qinlingsangye,Zhuosexiang,TakatsumaandMarsSeedlessrespectively.Theresearchresultscanbeusedasaparenttobreednewdisease-resistantvarieties.Moreover,italsoprovidesthebasisfortheproductionofcultivationandselectionofvarieties.(2)Theresultsshowedthattheresistanceofwhiterotwassignificantlyrelatedtothesizeofstomataandthicknessofspongetissue,andBotrytiscinerearesistancewasonlyrelatedtothicknessofspongetissue.(3)Accordingtotheenzymeactivityof45grapevarietieswithdifferentresistancetodisease,ItisconcludedthattheresistanceofgrapevarietiesispositivelycorrelatedwithCATandPODactivity,andtheresultscanbeusedasanauxiliarystandardfortheidentificationofresistanceofgrapevarieties.Keywords:Grapevarieties,Whiterot,Botrytiscinerea,Resistanceidentification2 沈阳农业大学硕士学位论文1前言1.1葡萄抗病性及其研究进展抗病性在植物病理学中的解释为寄主植物受到病原物侵染以后所发生本能的抑制或延缓反应，也可以理解为病原物侵染后出现了危害植物生长发育的现象（Keen,1992），其导致了抗病基因不能有效表达，最终在形态结构和生理生化等方面产生作用，从而表现在植物的外在形式上。最早的假说认为植物品种所携带的抗病基因和与之相应的病原物的无病基因相互作用才产生的抗病表现（Flor,1971）。可以将抗病性分为垂直抗性假设(Vanderplank,1987)和水平抗性假设(王金生，2001)：垂直抗性和水平抗性分别表现为质量遗传与数量遗传，垂直抗性特点为抗病应变性明显，抗病性水平相对较高；水平抗性的致病率较低、潜育期相对较长并且产孢量较少。寄主植物不同所表现的抗性反应程度也存在差异，即使同种病原物对同一类植物的致病的程度也有分别。致病效果强弱是多方面因素综合作用的结果，寄主植物的物质基础、形态结构、生理生化和抗病基因等等都与其相关。根据寄主植物对病原物侵染后的反应，可分为免疫、高抗、抗病、感病和高感五个等级，致病力越强抗性越低。种植作物要了解其抗病的类型与生长的能力，需通过鉴定的方式得出寄主植物的抗病性强弱，并且在筛选后代时抗性鉴定也是抗病育种的重要手段，可用于植物抗病类型的鉴别和抗病程度的评定，不限制于人工接种发病还是自然流行病害。田间鉴定与人工接种鉴定可以结合综合分析植物的抗病程度（仝倩，2018）。田间鉴定是最为基础的、操作简单且保存病感株简易（林成辉，2002）。室内离体苗期鉴定是指在人工可控温度、湿度等植物生长需要环境中进行的抗病性鉴定方法，该优势为可缩短周期苗期鉴定，分析单环境因子对抗病性的影响，不受自然条件及生长季的限制（邵登魁，2006）。离体鉴定是在局部组织或细胞水平就能表达出的抗性鉴定，在烟草黑胚病、玉米大斑病还有稻瘟病早有报道(韩美丽，2009)。近十年来看，在抗病性方面葡萄新品种的培育有明显增加的趋势（崔腾飞，2018）。葡萄种质资源研究种类主要包括4个类别，分别为东亚种群、欧洲种群、美洲种群和特殊类型的圆叶葡萄。东亚葡萄种群中的山葡萄具有较强的抗病性和极强的抗寒性；圆叶葡萄抗白粉病性极强；欧洲葡萄抗病性相对比较低，品质好，为使其提高抗性需要人工喷洒药剂。葡萄种质资源中各类种群对于不同病害具有不同抗性，即使同一种群也会存在抗性差异。Boubals（1961）经过试验得出抗白粉病较强的有美洲葡萄、沙地葡萄、河岸葡萄、冬葡萄，霜葡萄和甜冬葡萄次之；贺普超与王国英（1986）认为瘤枝葡萄、复叶葡萄、秋葡萄、华北葡萄、华东葡萄、燕山葡萄和菱叶葡萄对霜霉病抗性强，而秦3 前言岭葡萄刺葡萄、桦叶葡萄、毛葡萄、麦黄葡萄、网脉葡萄和米葡萄抗病性较弱；张剑侠（2006）通过研究认为甜冬葡萄、峡谷葡萄、冬葡萄、山平氏葡萄、圆叶葡萄等对抗黑痘病的抗性很高。周思泓等（2018）调查的大部分美洲种群或东亚种群的品种都具有白粉病抗性。唐兴敏等（2018）调查发现对霜霉病免疫品种有康拜尔早生；高抗的有阳光玫瑰、美乐等5个品种；中抗的有贝达、小芒森'等6个品种；抵抗的有瑞都红玉、早黑宝、摩尔多瓦等10个品种。1.2葡萄白腐病的研究进展1.2.1葡萄白腐病起源与分布19世纪意大利人Petrak（1953）首次提出了葡萄白腐病。现今世界各地的葡萄生产区都曾遭受过葡萄白腐病的危害（刘崇怀等，2006），致使葡萄产量以及质量受到极大影响。白腐病菌一般是从植物伤口侵入，风害、降雨等气候原因也可造成伤口导致植物幼叶和果穗受到病菌的侵染（陈彦等，2006），所以大多暴风雨后常引起大范围的白腐病盛行期，但如何传入到中国并无人清楚（王忠跃，2009），白腐病发生范围广泛，我国的葡萄主要生产区也同样受到其危害，病害的流行趋势呈上缓慢而稳定的升态势并未见其下滑。我国东北产区由白腐病直接导致的葡萄年损失可达到25%左右，高温高湿季节，该病危害将更加严重，严重年份损失可高达75%以上，甚至失收。1.2.2葡萄白腐病发病规律无性态白腐垫壳孢（ConielladiplodiellaPetraketSydow），属半知菌亚门垫壳孢属，是导致葡萄发生白腐病的主要病原菌。葡萄白腐病对于葡萄产量存在着较为严重的损害，葡萄白腐病原菌能够耐受外界自然恶劣的环境，生存能力较强，当面对自然界较恶劣环境时，可以分生出孢子，以起到较好抵抗外界危害的作用。葡萄白腐病在温度为15-35℃之间均可以产生，但其萌发的最适温度为28℃左右，湿润的环境有利于葡萄白腐病的生长，可使其发病率上升至70%，是一种高温高湿性的真菌（孔庆山，2004）。寄生阶段（短时期）和土壤内休眠阶段（长期）是病原菌的生长过程中的两个主要阶段。葡萄白腐菌主要通过分生孢子器、菌丝体以及寄生在植株残体组织上越冬，这些越冬的病原组织主要分布于果园的地面以及果树树体上，等到春天天气转暖，外界自然环境适宜，前一年分生出来的孢子就会在土壤中生长，借助春雨、冰雹以及尘土传播，可以通过果树的伤口、皮孔等部位，进一步侵入葡萄果穗或果梗。夏天自然界温度较高，降雨量较大，在这种高温潮湿的环境中，病原菌可迅速侵入果实伤口、果穗，导致果实的腐烂，造成大面积减产。因此，夏季田间高温潮湿的环境促进了葡萄白腐病病害的流行。4 沈阳农业大学硕士学位论文1.2.3葡萄白腐病症状表现通常在距离地面越近的地方葡萄的发病率越高，主要原因是与空气的流通相关，越贴近地面，空气流通越慢，所形成的低氧的条件越有利于真菌的生长与繁殖。感染发病后最先出现水渍状的褐色病斑，形状不规则，使得整个果粒失去光泽。病变部位进一步发展，开始出现腐烂，然后很快就能侵及果粒，病果粒变得软腐，之后病原菌会在表面分生出颗粒状灰色分生孢子器，当外界环境潮湿时，大量黑色粘稠分生孢子会在病果粒上产生，并伴随出现土腥味。之后病果粒逐渐萎缩干瘪变为僵果，严重影响了葡萄果实的品质与产量（贺普超，1999）。当白腐菌感染葡萄的枝蔓时，同样也会出现形状不规则的水浸状褐色病斑，病斑逐渐向四周蔓延，然后会在枝蔓表面出现大量的分生孢子器，使得枝蔓表皮逐渐干枯变皱。若病斑延伸至表皮一周，则其上部的枝蔓就会枯黄易折断，后期与木质部分离如麻丝状（霍兆志，2008）。叶片的边缘或尖端常受到侵染，出现褐色的水浸状病斑，并向叶中部靠近且病斑扩大，成同心褐色宽带轮纹并在叶面长出白色分生孢子器，后期枯死（赵凤环和张惠超，2011）。1.2.4葡萄资源对白腐病的抗性进展普遍认为东亚种群和欧美种群抗白腐病抗病性较强，而欧亚种葡萄的抗白腐病抗病性一般（贺普超和晃无疾，1983；董阳辉，2011）。中国野生葡萄资源中山欧杂种、山美杂种、美洲杂种以及美洲种群种质抗性强，欧亚种种质抗病性一般（李峰等，2012），这与贺普超和董阳辉的研究结果相同。酿酒葡萄中欧亚种的酿酒葡萄白玉霓、西拉、赤霞珠、白诗南抗病性较好，长相思、雷司令、黑比诺、梅鹿特抗性较差（王跃进和贺普超，1993）。刘天明等（2001）认为田间自然环境下野生种的葡萄都不会被白腐病真菌病害所侵染，但目前仅发现部分抗病和感病种质，如抗病性较低的有秋葡萄、华东葡萄、毛葡萄、华北葡萄和复叶葡萄等；刺葡萄与山葡萄的抗病性相对较高，还没有发现绝对免疫的种质资源。1.3葡萄灰霉病的研究进展1.3.1葡萄灰霉病起源与分布葡萄灰霉病（BotrytiscinereaPers）是一种世界性真菌病害，也是人类历史上最早被研究和描述的真菌病害，18世纪被希腊人首次发现（刘长令，2000），之后19世纪60年代，发现其有性后代Botryotiniafuckliana（Brentetal.,1998）。到1980年,葡萄灰霉病已发展成制约葡萄经济生产的最大病害之一。现在随着设施葡萄栽培的兴起，大棚5 前言内温湿度小气候环境十分有利于灰霉病病菌的侵染与危害，灰霉病成为设施葡萄生产的主要病害，并随着设施栽培面积的扩大而日益严重。目前，虽采用高效能杀菌剂，但因葡萄灰霉病造成的损失仍高达20%-50%。1.3.2葡萄灰霉病发病规律葡萄灰霉病病原BotrytiscinereaPers，为灰葡萄孢菌属半知菌亚门真菌。灰葡萄孢菌寄主范围广泛，是一种兼性寄生菌，可使多种蔬菜、花卉与水果等受害。病菌以菌核、分生孢子及菌丝体随病残组织在植物体或土壤中越冬。病菌与菌核分别在2-31℃、3-27℃下萌发，菌丝最适温度为20-24℃，当温度达到15℃，相对湿度85%以上即可发病。若温度20℃，相对湿度90%以上则病害迅速发生。病菌寄生性较弱，菌核为主要的越冬方式，部分菌丝体也可以在树皮和冬眠芽上越冬。无论是植物体还是土壤中的温度和湿度都可使其存活。菌核和分生孢子的抗逆性都很强，翌春气候条件适宜时，越冬的分生孢子及菌核即可萌发产生新的分生孢子，其通过气流即可传播到花序及幼果穗上，当植物幼嫩部位受到外界刺激后外渗物质极易侵染萌发生成新一代孢子，此时大量的孢子可以进行大规模的传播。若气温较低、湿度较高还遭遇暴风雨、鸟类、昆虫或农事操作等造成伤口增多时，在葡萄的花期或座果期极易诱发一场严重的流行性病害。1.3.3葡萄灰霉病症状表现葡萄灰霉病菌主要侵染花序、果穗和幼果。也能危害新梢、叶子、果梗和着色期的果实等。花序与幼果感病，则先表现在花托和果柄上出现淡褐色的、水浸状小病斑，而后变暗褐色软腐状。天气潮湿病斑处会长出一层鼠灰色霉状物，其为病原菌分生孢子梗与分生孢子。干燥时感病花序、幼果会失水、萎缩，到干枯脱落，形成大量的落花落果，甚至会整穗掉落；新梢与叶子感病，就产生浅褐色、不规则病斑，部分病叶会出现模糊状轮纹，最后病斑也产生灰色霉层；着色期的果实感病，表面出现褐色的凹陷病斑，可扩大道整个果实完全腐烂，其原因是果皮裂缝处先产生孢子，在侵染到全部果实，果皮表面出现鼠灰色的霉层或伴有黑色菌核。1.3.4葡萄资源对灰霉病的抗性进展灰霉病抗性在葡萄属植物中的葡萄种内与种间都呈现出了很大的差异性，一般东亚种群抗灰霉病的能力较强，欧亚种葡萄能力略低些，大都认为欧洲鲜食葡萄的抗病性更低(Gableretal.,2003)。酿酒葡萄品种中赤霞珠（Cabernet）、梅鹿辄(Merlot)、西拉(Syrah)和雷司令(Riesling)较霞多丽(Chardonnaycultivar)与白诗楠(WhiteShinan)的抗灰霉病强，其中万然（2016）的研究结果与Gableretal.相似的为红地球、玫瑰香等不具有抗性，但不同是户太8号和代北醇也较低，中国野生葡萄种质中山葡萄双优、通化3号、燕山葡6 沈阳农业大学硕士学位论文萄燕山-1和秦岭葡萄平利-5等的抗病性都极高，尤其是山葡萄抗性最高(姜建福等，2010)。可以看出中国野生葡萄是葡萄抗病育种的非常珍贵资源，许多中国的野生葡萄均对常见病害具有极高的抗性，部分资源可能有对多种常见病害的抗性(贺普超等，1991)。1.4葡萄抗病结构的研究现状预存与诱导抗性是抗病的两种方式。一般在植物受到病原体侵染后所诱导形成枯斑而且可以产生体内抗性的为诱导抗性，而植物体所具有的角质层、蜡质层、木质素和气孔的特殊结构等成为预存抗性（Pieterseetal.,1998;Nakashitaetal.,2003）。在预存抗性的研究领域里有很多关于叶片方面的的研究。1980年，周亮高(1980)认为植物表皮气孔的大小和密度与真菌孢子浸染率有着密切的关系，并且气孔大小和密度影响着杨树黑斑病的抗病性（韩正敏等，1998），气孔大小和密度影响也与山葡萄霜霉病抗性和大豆抗灰斑病抗病性呈正相关（艾军等，1995；李海英，2001），与草坪草叶枯病抗性和哈密瓜果斑病抗性为负相关（徐秉良等，2003；翟艳霞，2006）。木质素和角质较高可以分别提高甘薯抗茎线虫病的抗病性、黄瓜抗白粉病抗病性与花生抗疮痂病的抗病性（林茂松，1996；朱键鑫，2008；方树民，2007）。武春霞等（2016）利用叶片解剖结构分析出西府海棠抗旱性较高，北美海棠的抗旱性一般，珠美海棠抗旱性较差，长柄扁桃也可利用其分析出抗旱性关系（郭改改等，2013）。通过对叶片显微结构的比较分析可以得出梨叶片抗旱性程度（葛红娟，2010）。汝学娟等（2018）在番茄上发现抗病品种的绒毛比感病品种的绒毛多。郑伟等（2018）得出叶片气孔的密度可作为苹果白粉病的形态结构的初步鉴定指标。黄瓜叶片蜡质含量显著增高可能是突变体对白粉病抗性增强的原因之一（戎福喜等，2017）。气孔密度和蜡质含量与品种枯萎病的抗病性呈正相关（李伯凌，2017）。由此表明，叶片结构不仅是植物自身的重要器官，还是科研人员研究气体交换、水份代谢和营养代谢的一种重要途径。葡萄属（VitisL）植物在野生果树的种质资源中占据重要地位，目前一共有种类60左右,亚热带是主要的气候分布区域。我国拥有的36种本属材料，有着最广泛的变异性。有大量资料表明，解剖结构早已应用在萄萄科植物领域，最早研究的是茎的显微结构(Adkisnon,1913)。1950年，Metcalfe(1950)对之前的葡萄科解剖学进行了整理归纳。Zubkvoa(1975)将葡萄科的90多种叶柄比较分析，得出维管束可分为：假环型、分离型和闭环型三种主要类型并奠定了其系统学基础。Latif(1980)通过对葡萄属植物的解剖结构观察可确定种属间亲缘关系为其提供了重要依据。王丽丽等（2017）发现葡萄叶片厚度和茸毛密度与其对绿盲蝽的抗性之间没有显著相关性。王国英(1988)和艾军等（1995）对气孔结构和密度与葡萄对霜霉病的抗性关系进行了调查，表明叶气孔大小、密度与霜7 前言霉病的病情指数呈正相关。缴莉（2017）通过叶片显微观察发现，山葡萄‘左山一’转基因后的葡萄叶片霜霉菌生长更快。目前来看叶片结构与霜霉病的报道有很多，但关于白腐病和灰霉病的较少。1.5葡萄抗病性与生理指标的研究现状植物抗病性和植物酶活性有着密切的联系。当植物受到外界刺激时植物体内会出现应激反应，进而引起应激酶的一系列变化来缓解或阻碍植物不良反映的发生（邢会琴，2003；石雪晖，1997）。POD酶是主要减缓机体氧化反应发生的主要酶之一(郭文硕和黄宗安，2000)，其作用和PPO酶作用相似均为促进和氢氧化酚物链性反应生成醌类物质并促进成熟化的一系列反应加速（蒋选利等，2001）。SOD酶活、PAL酶活和CAT酶活都对植物的抗病性有一定的相关性，CAT（过氧化氢酶）是一种光调蛋白，用于清除多余的活性氧。苯丙氨酸解氨酶(PAL)在植物次生生长中对木质素、植保素的反应过程起到重要作用（刘延林等，1997；苗则彦等，2003）。抗性有关酶调节植物抗性反应生理生化到改变抗性表型结构起到很大作用，研究酶活性的变化规律从而了解植物抗性的能力强弱。近些年来国内外学者从植物物质生理生化变化的角度研究病害发生机理，并取得了许多成果。在1811泰纳尔就发现可以降解过氧化氢的酶即为CAT，1937的詹姆·B·萨姆斯继续进行研究，发现过氧化氢酶主要作用就是清除多余活性氧，保持动态平衡（Beckmanetal.,1994），使植物体开启自保模式中的防御机能(禹宽平，1995)，POD对清除活性氧及过氧化氢也有重要作用（魏国强等，2004)，通过降低或抑制细胞内物质的氧化从而到保护膜完好的作用（惠勒，1979），主要是清除或阻碍细胞过氧化氢的危害（Prochazkovaetal.,2001;QuartacciNavari-Izzo,1992）。当遇到病原物侵染时，值物体防御酶系统将快速启动来应对病变产生的伤害，但不同植物体内快速应激酶种类不同，常见应激酶包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等等。由此可见，酶与植物抗病性的关系十分密切。据研究表明POD活性对葡萄黑痘病、水稻白的叶枯病、棉花和黄瓜的枯萎病都起到重要作用，表现为品种抗病性越高，POD活性越高，即成正比（杨国顺，1997；吴岳轩等，1996；李妙等，1993；王玲平等，2001），与JosephLM等（1998）的研究一致，WoodRS等(1980)与钟秀芬（1992）则认为POD活性和植物的抗病性成负相关，史娟和杨之伟（2006）认为POD的活性与葡萄的抗病性有很大联系，李宝燕等（2018）认为葡萄品种间的抗病性与POD、CAT活性存在一定相关性。GolodrigaPI（1981）得出葡萄感病叶片的POD活性均高于健全叶片。陆建英等（2018）发现豌豆感染白粉病8 沈阳农业大学硕士学位论文后，POD活性呈上升趋势，CAT活性呈先升后降的变化趋势。南瓜疫病的健全叶片POD活性则与抗病性无关，但染病叶POD活性初增加时的涨幅和之后的下降幅度均低于感病植株(周克琴等，2003)。芦笋对茎枯病的抗性与POD存在一定相关性（王珊珊，2018）。Marudtyan等发现葡萄霜霉病抗性低的品种PPO活性降低，抗性高的葡萄PPO活性升高。1.6本研究的目的与意义近些年来，随着栽培面积和产量的不断加大，葡萄易受许多病原体如细菌、病毒、植原体、真菌等的侵染，葡萄白腐病和灰霉病可导致欧亚种及欧美杂交种栽培生产园减产高达25%-75%与20%-50%，在世界范围内的大多数葡萄的种植区都有该病的发生。葡萄的病害日趋严重，不仅会造成葡萄产量和品质的下降，还会生产者带来巨大的经济损失。目前生产上对该葡萄病害防治主要措施是药剂防治，但长期使用化学农药，一是将增加人力、物力和生产成本，二是农药的残毒存在对环境污染日益加重，三是受天气的影响较大，所以为了秉承绿色发展和健康安全的可持续理念，选择利用抗性种质和筛选种植抗病性强的品种并将其应用于生产是非常有意义的。目前，品质生活逐渐成为人们的主体趋势，人们追求安全、绿色、无公害的生活产品。为此，提供安全优质的葡萄是所有葡萄工作者的共同目标，本研究以101份葡萄品种为研究对象，在离体条件下对叶片进行抗病（白腐病和灰霉病）鉴定，观察其显微结构和测定叶片相关理化指标，从多角度出发为生产上筛选和栽培抗白腐病或灰霉病品种提供相关参考依据，为葡萄病害抗性基质及抗病新品种的选育提供亲本选择。9 葡萄品种资源抗病性鉴定2葡萄品种资源抗病性鉴定从20世纪50年代，白腐病成为葡萄种植区的主要病害之一。80年代初，灰霉病成为南北方葡萄产区的主要病害，也是北方设施栽培的主要病害，二者均主要危害葡萄果实，对葡萄的生产造成了巨大的经济损失。我国葡萄种植区域覆盖了全国各个省市，且各地区种植品种多样，为了了解不同葡萄品种对该类病害的抗病性大小。本研究通过对101份葡萄品种分别进行白腐病和灰霉病的抗性鉴定，为生产上筛选和栽培抗病品种提供参考依据。2.1试验材料本试验以101份葡萄品种资源为试材，均取自沈阳农业大学后山葡萄试验园（126°33′41″E，41°49′24″N）。采用避雨棚龙干式栽培且长势良好。试验于2017年6月-8月份进行。101份葡萄品种详见表2-1。表2-1鉴定材料Table2-1Identificationmaterials材料编号材料名称种群MaterialMaterialnameVarietiesgroupsnumberG187-1871欧亚种V.viniferaLG2LN333LN333欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G3阿富汗Afghan欧亚种V.viniferaLG4爱墨无核EmeraldSeedless欧亚种V.viniferaLG5爱神玫瑰AishenMeigui欧亚种V.viniferaLG6白可玉哥Cayugawhite欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G7白香蕉GoldMuscat欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G8北冰红Beibinghong欧山杂种V.viniferaL×V.amurensiRuprG9碧香无核BixiangWuhe欧亚种V.viniferaLG10布朗无核BronxSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G11赤霞珠CabernetSauvignon欧亚种V.viniferaLG12达米娜Tamina欧亚种V.viniferaLG13粉红亚都蜜YatomiRosa欧亚种V.viniferaLG14峰后Fenghou欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G15高妻Takatsuma欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G16公酿1号GongniangNo.1欧山杂种V.viniferaL×V.amurensiRuprG17公主白Gongzhubai欧山杂种V.viniferaL×V.amurensiRuprG18光辉GuangHui欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G19寒香蜜无核SuffolkRed欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G20好力壮Horizon欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G21河岸葡萄Hehan河岸葡萄V.ripariaMichxG22黑奥林BlackOlimpia欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.10 沈阳农业大学硕士学位论文材料编号材料名称种群MaterialMaterialnameVarietiesgroupsnumberG23黑巴拉Heibala欧亚种V.viniferaLG24黑香蕉Heixiangjiao欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G25红地球RedGlobe欧亚种V.viniferaLG26红光无核FlameSeedless欧亚种V.viniferaLG27红乳Hongru欧亚种V.viniferaLG28红瑞宝Benizuiho欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G29沪培1号HupeiNo.1欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G30皇冠Huangguan欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G31火星无核MarsSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G32甲斐乙女Kaiotome欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G33金玫瑰Jinmeigui欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G34金星无核VenusSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G35津南早红Jinnanzaohong欧亚种V.viniferaLG36京亚Jingya欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G37京玉Jingyu欧亚种V.viniferaLG38京早晶Jingzaojing欧亚种V.viniferaLG39井川666JingCuan666欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G40巨峰Kyoho欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G41巨玫瑰Jumeigui欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G42康可Concord美洲种V.labruscaL.G43康能无核Canadice欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.KhoussaineKhelimeG44克林巴马克欧亚种V.viniferaLBarmakG45克瑞森无核CrimsonSeedless欧亚种V.viniferaLG46昆诺无核QueenoraSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G47老君山桦叶Laojunshanhuaye桦叶葡萄V.betulifoliaDielsG48雷蒙无核LakemontSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G49雷明无核RemailySeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G50里扎马特Rizamat欧亚种V.viniferaLG51龙宝Ryuho欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G52马奶MaNai欧亚种V.viniferaLG53玫瑰香MuscatHamburg欧亚种V.viniferaLG54玫瑰怡Meiguixiang欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G55美国绿Meiguolv欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G56蜜红Mihong欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G57蜜汁Mitsushiru欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G58瓶儿Ping'er欧亚种V.viniferaLG59葡萄园皇后QueenofVineyard欧亚种V.viniferaLG60普利亚特河岸PuliyateHean河岸葡萄V.ripariaMichxG61秦岭桑叶qinlingsangye桑叶葡萄V.ficifoliaBungeG62秋无核AutumnSeedless欧亚种V.viniferaLG63沙地葡萄SadiPutao沙地葡萄V.rupestrisScheele11 葡萄品种资源抗病性鉴定材料编号材料名称种群MaterialMaterialnameVarietiesgroupsnumberG64沈农金皇后ShennongJinhuanghou欧亚种V.viniferaLG65沈农硕丰ShennongShuofeng欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G66沈农香丰ShennongXiangfeng欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G67沈阳玫瑰ShenyangMeigui欧亚种V.viniferaLG68双丰Shuangfeng山葡萄V.amurensiRuprG69双红Shuanghong山葡萄V.amurensiRuprG70双庆Shuangqing山葡萄V.amurensiRuprG71双优Shuangyou山葡萄V.amurensiRuprG72斯凯勒Schuyler欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G73汤姆森无核ThompsonSeedless欧亚种V.viniferaLG74藤稔Fujiminori欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G75天山Tenzan欧亚种V.viniferaLG76甜冬葡萄tiandong甜冬葡萄V.cinereaEngelmG77维多利亚Victoria欧亚种V.viniferaLG78温克Wink欧亚种V.viniferaLG79无核白鸡心CentennialSeedless欧亚种V.viniferaLG80无核红宝石Rubyseedless欧亚种V.viniferaLG81无核早红WuheZaohong欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G82夕阳红Xiyanghong欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G83夏黑SummerBlack欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G84香妃Xiangfei欧亚种V.viniferaLG85香悦Xiangyue欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G86新华1号XinhuaNo.1欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G87信浓乐xinnongle欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G88信阳华东xinyanghuadong华东葡萄V.pesudoerctiualatW.T.WangG89阳光玫瑰ShineMuscat欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G90意大利Italia欧亚种V.viniferaLG91早黑宝Zaoheibao欧亚种V.viniferaLG92早夏无核ZaoxiaSeedless欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G93泽香Zexiang欧亚种V.viniferaLG94着色香Zhuosexiang美洲种V.labruscaL.G95状元红Zhuangyuanhong欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G96紫地球Zidiqiu欧亚种V.viniferaLG97醉金香Zuijinxiang欧美杂种V.viniferaL.×V.labruscaL.G98左红一Zuohongyi山葡萄V.amurensiRuprG99左山二Zuoshaner山葡萄V.amurensiRuprG100左山一Zuoshanyi山葡萄V.amurensiRuprG101左优红Zuoyouhong欧山杂种V.viniferaL×V.amurensiRupr12 沈阳农业大学硕士学位论文2.2试验方法2.2.1培养基配制及菌的扩繁葡萄白腐病病原菌及灰霉病病原菌都是一种真菌性微生物。依照其生存的生物学特性，利用马铃薯葡萄糖琼脂培养基打造出适合其生长繁殖所需的环境。具体操作步骤如下：（1）制取PDA培养基将去皮洗净的马铃薯称取200g，切为小碎块放入锅中，加入1000mL蒸馏水，加热至其沸腾，沸腾后继续煮约30min将马铃薯煮烂（用玻璃棒轻戳可破）为准，再用四层纱布将其过滤到烧杯中，保持滤液清透，待滤渣成团态则进行下一步。用蒸馏水将滤液补足至1000mL，再将琼脂粉20g和葡萄糖20g加入，用玻璃棒搅拌并适当加热促使其充分混合，待完全溶解后，将配置好的PDA培养基分装到两个1000ml的锥形瓶中，每瓶装入500ml培养基这样可以避免不必要的污染。（2）灭菌及接菌将锥形瓶加塞包扎后，利用Panasonic灭菌锅在121℃下灭菌，30min后取出，在消毒好的超净工作台上将培养基分别倒入新培养皿中，晾至室温后，将待扩繁菌菌块挑出放在培养皿中心位置，最后用封口膜封严，放在培养箱中培养。2.2.2白腐病菌丝培养葡萄的白腐病病原菌Coniothyriumdiplodiella(Speg)来自北京市农林科学院植物保护研究所，该病原菌是一种真菌微生物为葡萄专性寄生，可以使用PDA（PotatoDextroseAgar）培养基离体密封培养，在28°C黑暗下，培养3天，菌丝均匀分布但未产生孢子时放在4°C下保存备用。2.2.3灰霉病原菌孢子培养葡萄的灰霉病病原菌BotrytiscinereaPers来自北京市农林科学院植物保护研究所，该病原菌是一种真菌微生物为葡萄专性寄生，可以使用PDA（PotatoDextroseAgar）培养基离体培养，在21°C100%相对湿度，16h光照，8h暗光黑暗下，培养3-5天，灰层形成时取出，用涂布器将PDA培养基中的孢子刮下，制成孢子悬浮液，并在万能显微镜下观察，以25×16型的血球计数板进行浓度计算，始最终孢子侵染浓度为1×105个/ml时活力最高再进行侵染。2.2.4葡萄品种资源的白腐病抗性鉴定利用室内离体叶片接种法对葡萄进行白腐病抗性鉴定，具体操作方法为：均采取当年生枝条上第三到第五片成龄的叶片，每个植株选取3个叶片，用蒸馏水清洗干净后擦13 葡萄品种资源抗病性鉴定干待用，菌块采用经高温灭菌后直径为7mm的打孔器在培养好的白腐菌菌落边缘打下若干个，避开叶片的主脉刺伤并将菌块(CK)分别接种叶片正面的伤口处，每个叶片接种3处，同时设3个生物学重复，再将接种后的叶片置于培养皿下底内保湿，上盖覆有浸湿但不接触叶面且不滴水的滤纸，用封口膜密封保湿，并放在条件为28℃；100%相对湿度，16h光照，8h暗光的培养箱（MLR-352H-PC，Panasonic）内培养，放置24h后将叶片上的菌块取出并继续培养48h，最后使用智能叶面积测量仪（型号YMJ-C）统计并做好记录，进行抗性调查。参考前人的研究方法后略做改进(CAIDetal.,1997;张颖，2017a)。根据病斑面积所占全叶面的百分比划分成7个等级：一级：0.1%~5.0%；二级：5.1%~15.0%；三级：15.1%~30.0%；四级：30.1%~45.0%；五级：45.1%~65.0%；六级：65.1%~85.0%；七级：85.1%~100.0%。再将7个病症等级转化为病情指数（DI）。计算公式如下：以DI≤8.00%为高抗类型(HR)；在8.00%感病>抗病>高抗>高感。抗灰霉病品种的抗性分级有两个峰值，分别处在抗病和感病区域，其排序则为抗病>感病>中抗>高感>高抗。在101份葡萄品种里，抗白腐病至少为中抗类别的占69.31%，其中中抗品种43份，所占42.57%。抗灰霉病至少为中抗类别的占62.37%，其中抗病品种44份，所占43.56%。图2-5葡萄品种资源抗性级别的次数分布图Fig.2-5DistributionplotforresistanceofdifferentgrapevarietalresourcestowhiterotandB.cinerea2.4讨论白腐病和灰霉病是严重威胁葡萄生产的病害，我们以101份葡萄品种为研究对象，对其进行离体叶片抗白腐病和灰霉病抗性鉴定和评价，为今后生产中抗病品种推广和育种中亲本选择提供参考。关于葡萄白腐病的研究，张颖（2013a.b；2017）通过调查发现欧亚种葡萄在离体鉴定中抗性分布于HS~R，没有HR类型，大多属于S和HS型。中国野生葡萄资源在自然条件下均不表现葡萄白腐病的症状，在离体鉴定中抗性分级分布于HS~HR的各个级别；王跃进和贺普超（1988）试验得出抗病最强的刺葡萄，华东葡萄与山葡萄等中均存在抗性强的种质与感病种质。本试验也得出无论中国野生葡萄还是欧亚种葡萄，其种间抗性都有很大的差异，同一群体中可能包含不同的抗性类型，如河岸葡萄中包含抗性和中抗类型，欧美杂种葡萄中存在高抗、抗病、中抗和感病4种类型，21 葡萄品种资源抗病性鉴定这一现象也存在于欧亚种中，欧亚种包含了抗病、中抗、感病和高感类型。许多研究人员推测外在因素有可能为地理环境和人为因素，内在因素可能为基于细胞内基因表达调控所造成了抗病差异（PandeyandSomssich,2009）。李峰等（2012）通过调查田间自然鉴定发现，从总的趋势来看，美洲种、欧山杂种对葡萄白腐病抗性最强，其次为欧美杂种，欧亚种最不抗病，本研究结论与其一致，表明抗病性结果可应用性高，可为生产上筛选和栽培抗白腐病或灰霉病品种提供相关参考依据。在关于灰霉病的报道中，段慧（2013）研究发现室外活体接种与室内离体接种得出的结果基本一致，红宝石无核与红地球葡萄均为灰霉病的感病类型，这与本研究结论一致。万然（2016）研究发现种内不同葡萄品种抗灰霉菌的水平存在不一致现象，山葡萄具有高度抗灰霉菌抗性，例如双优、通化3号和秦岭葡萄平利-5等抗性最高。Gabler等人调查发现常见欧洲葡萄易感灰霉病，中国野生种葡萄、美洲种葡萄或者其杂交后代具有高抗灰霉菌的特性，其调查如红地球、玫瑰香等均不具有抗性，与本试验的结果相同。22 沈阳农业大学硕士学位论文3葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究近年来叶片的显微结构一直被研究人员密切关注。叶片是病原菌最易侵染的结构之一，其具有先天性形态结构（预存抗性）对植物的抗病性具有重要的意义。探究其与植物真菌性病害抗病性的关系十分重要。本试验通过对不同抗性的30个葡萄品种进行观察，分析品种间叶片结构与抗病性的关系，为研究抗病机制提供相关性理论依据。植物受到病原物等侵染时，产生一定的应激防御反应，使植物体内得不同防御性物质产生差异变化。不同抗性材料表现出的病害严重程度存在差异。相关研究表明，葡萄叶片酶活性对抗病性有着紧密的联系。CAT与POD均可称为防御性酶，酶活性的变化可能与葡萄本身抗性有关。本试验通过对抗灰霉和白腐病有不同抗性的45个葡萄品种进行研究。测定各品种病害侵染前后防御酶的活性变化，进而分析不同抗性间酶活性变化的规律。3.1试验材料葡萄品种资源叶片显微结构观察相关试验，根据白腐病和灰霉病的抗病鉴定结果，以不同抗病类别和来源种类不同筛选出30份品种作为其观察对象。于2017年7月进行。在沈阳农业大学后山葡萄试验园当年生枝条上采取第四片成龄叶片（均5片），处于避光下带回，立即开始制取切片。供试品种详情如表3-1所示。葡萄品种资源生理生化研究相关试验，试验材料来源于沈阳农业大学后山葡萄试验园，分别在不同来源种类的抗病性强、中等抗病性和抗病性较弱中共挑选45个品种作为试验对象。于2017年7月中旬，在沈阳农业大学后山葡萄试验园采取第四片成龄叶片，每种品种选取9个叶片，用蒸馏水清洗干净后擦干，以3片为一组，留一组作为对照后其余两组分别进行白腐病和灰霉病侵染（侵染过程可参考第二章内容），以接菌当日为第一天，到第五天时将其以锡箔纸封存同时用液氮速冻，其后放入-80℃超低温冰箱（MDF-U74V,Panasonic）。再使用高通量研磨仪（TL-2020，HEROS-MOLE）在液氮下研磨，而后全部转离心管中，仍保存于-80℃超低温冰箱待用。供试品种详情如表3-1所示。23 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究表3-1部分葡萄品种对白腐病和灰霉病的抗性鉴定结果Table3-1IdentificationresultofresistancetowhiterotandB.cinereainsomegrapevarieties白腐病灰霉病白腐病灰霉病材料编号whiterotB.cinerea材料编号whiterotB.cinerea抗性抗性排名抗性抗性排名抗性抗性排名抗性抗性排名MaterialResistanceResistanceMaterialResistanceResistanceResistanceResistanceResistanceResistanceranknumberrankranknumberrankG1*HS30S5G63S25R3G4S27S6G64*MR17R3G7*MR19R3G65R4R3G9S20S6G66R5MR4G11MR16S5G67*MR19R3G16R6R3G68HR3R2G17MR18R2G69HR1R2G19MR19R3G70HR3R2G21MR14R3G71HR3HR1G22*MR18R3G73*S22S6G25*HS31HS7G74*R4R3G34R4HR1G76HR2R3G36*S22R3G79HS30HS7G37S25HS7G83*R10R3G40MR17R3G84*HS32HS7G41MR16R3G85R4R3G42R12HR1G88MR17S6G47MR15HS7G89*MR16MR4G50*MR18MR4G90S22HS7G53*S23S6G94R12HR1G57MR16R3G97MR16MR4G58*HS32HS7G101HR3R2G61MR15HR1HR：高抗，R：抗病，MR：中抗，S：感病，HS：高感；*标志的品种未进行切片观察HR:Highlyresistant,R:Resistant,MR:Middleresistant,S:Susceptible,HS:Highlysusceptible,*Themarkvarietyisnotobserved24 沈阳农业大学硕士学位论文3.2试验方法3.2.1葡萄叶片气孔显微观察试验选取当年生枝上的第四片成龄叶片作为观察材料，先用软毛刷清除叶片表面上的灰层，然后用直径为1cm的打孔器打取叶盘，每片叶盘在叶子上的位置相同且避开叶脉。采用撕取法（刘明智等，2005），将透明指甲油均匀涂抹于叶盘上，使其自然晾干，再用眼科镊子撕取下表层并放入滴有甘油的载玻片上，盖好盖玻片轻压将气泡挤出。将制好的切片在万能显微镜（BX51,OLYMPUS）下观察拍照。随机选取5个视野，在交叉尺的刻度内记录气孔个数，并对气孔的长度和宽度进行测量。3.2.2葡萄叶片横切面显微结构观察试验以当年生枝上的第四片成龄的叶片作为观察对象。通过徒手切片法（张书敏等，2015）观察葡萄叶片表层细胞厚度等显微结构，试验过程中所用透明剂是水合氯醛的饱和乳酸溶液，染色液为1%甲苯胺蓝的硼酸溶液。在实验台上叠放5-10张A4纸，将鲜叶片平铺于纸上。用两把全新的双面剃须刀片，平行放置后捏紧，刀口对齐，双手同时向下按压切割叶片，然后用细毛笔取下，放到装有透明剂的离心管中，将离心管扣好盖子，再70℃水浴1h，用蒸馏水清洗3次，挑出较好的切片将其转移至滴有水滴的载玻片上，吸去多余水分，之后用染色液一小滴染色15s后漂洗制成成片，最后在万能显微镜（BX51,OLYMPUS）下观察拍照，随机观察5个视野，并测定叶片显微结构中上表皮厚度、栅栏组织和海绵组织等的厚度。3.2.3葡萄叶片中过氧化氢酶(CAT)活性测定先进行粗酶的提取，在10ml的离心管中分别加入0.15g的PVPP和0.15g待测样品，加3ml的KPP混匀后静置浸提10-12h，4℃下，以8000r/min离心30min提取上清液，再继续以8000r/min，4℃下离心10min提上清液，即粗酶液，在4℃下保存。每个待测样品都设有3个重复。（所有过程均在冰上进行）每管样品均以其对应煮死的酶液为对照，取0.1ml酶液，1ml的Tris-Hcl，1.7ml的蒸馏水，25℃恒温下，加0.2mL0.lmol/L（现用现配）的H2O2溶液，每加一管迅速比色测定。对照以缓冲液替代酶液。3min内间隔30s读取1次，测定A240，以每分钟A240减少的0.1酶量为1个酶活力单位（张宪政，1992）。CAT(u·g-1·FW-1·min-1)=(△A240×Vt)/(FW×Vs×0.1×t)式中FW:样品的鲜重；Vt:酶提取液的总体积(mL)；Vs:测定时的用酶液量(mL)；t:测定的时间（min）。25 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究3.2.4葡萄叶片中过氧化物酶(POD)活性测定粗酶的提取步骤同4.2.2中相同。反应液（现用现配）为在50ml的100mmol/LKPP中加入28μl的愈创木酚，在磁力加热下搅拌直至溶解，冷却到室温后加19μl的30%H2O2混匀，测定时取3ml反应液和1ml酶液快速放在紫外分光光度计（DB-20R,HALO）上。以反应液替代酶液为对照。三分钟内每分钟读取一次，测定A470，以每分钟A470减少的0.1酶量为1个酶活力单位（李美如，1996）。POD(u·g-1·FW-1·min-1)=(△A470×Vt)/(FW×Vs×0.01×t)式中A470:反应时间内吸光度值的变化；FW:样品鲜重(g)；VS:测定取用酶液体积(mL)；t:反应时间(min)；Vt:提取酶液总体积(mL)。3.2.5数据处理分析用MicrosoftExcel软件进行试验数据初步处理，采用SPSS19.0软件进行数据处理分析，使用AdobePhotoshop软件进行图片处理。3.3结果与分析3.3.1葡萄叶片气孔结构相关数据分析气孔是植物体一个非常重要的器官，在蒸腾、光合与呼吸作用中起到气体交换的作用，是与外界联系的主要通道。将各叶片结构按抗性级别进行Spearman相关系数分析（表3-2），可以看出抗白腐病抗性类别和气孔大小在显著水平上存在差异，成反比例关系。灰霉病抗性分级未达到显著性差异。抗白腐病及抗灰霉病的抗性类别与气孔密度均不存在显著性关系。由表3-3可知气孔最小品种为沈农硕丰80.51μm2，双优（G71）103.19μm2二者均为抗病品种，高感品种无核白鸡心(G79)气孔为235.78μm2。图3-1AG71（抗病）葡萄叶片下表皮结构图3-1BG79（感病）葡萄叶片下表皮结构Fig3-1ABladestructureofG71grapematerialFig.3-1BBladestructureofG79grapematerial26 沈阳农业大学硕士学位论文表3-2葡萄叶片数据相关系数Table3-2Correlationcoefficientofgrapeleaf上表皮厚度栅栏组织厚度海绵组织厚度紧密度气孔大小气孔密度（μm）（μm）（μm）(%)(μm2)(个/mm2)EpidermisPalisadetissueSpongetissue2Poredensity(个CTR(%)Poresize(μm)thickness（μm）thickness（μm）thickness（μm）/mm2)白腐抗性0.1210.0260.463**-0.1670.445*-0.274类别灰霉抗性0.1920.1740.524**-0.0920.0170.166类别试材总数303030303030N*为显著水平上存在差异；**为极显著水平上存在差异*Thereisadifferenceinthesignificantlevel;**isthedifferenceintheextremelysignificantlevel3.3.2葡萄叶片横切面观察及相关数据分析叶片为白腐病菌和灰霉病菌侵染时最先接触的植物体结构，由蜡质层、表皮层和栅栏组织等构成的预存抗性。从表3-2可以看出，将各结构按抗性级别进行相关性分析，得出白腐病和灰霉病的抗性类别与海绵组织厚度存在极显著性差异，且均呈负相关。由表3-3和图3-2可看出，高抗品种双优（G71）的叶片表皮组织、栅栏组织和海绵组织间结构十分紧密，其海绵厚度为52.12μm，高感品种无核白鸡心(G79)的叶片表皮组织、栅栏组织和海绵组织间结构比较疏松，其海绵厚度为81.01μm。图3-2AG71（抗病）葡萄叶片结构图3-2BG79（感病）葡萄叶片结构Fig.3-2ABladestructureofG71grapematerialFig3-2BBladestructureofG79grapematerial27 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究表3-3葡萄叶片相关数据分析Table3-3Differentgrapematerialbladerelateddataanalysisofvariance白腐病22材料编号材料名称灰霉病抗性气孔面积(μm)单位面积气孔(个/mm)栅栏组织厚度（μm）海绵组织厚度（μm）上表皮厚度（μm）栅海比%抗性PalisadetissueMaterialMaterialWhiterotB.cinereaStomatalareaperPalisadetissueSpongytissueUpperepidermisStomatalareathickness/SpongynumbernameResistanceResistanceunitareathicknessthicknessthicknesstissuethicknessG4爱墨无核SS436.46±33.10bc184.72±10.39hij43.30±2.00m85.42±1.04a16.81±2.55cdef50.68±0.018opG9碧香无核SS295.07±10.48ghi159.68±10.16jkl59.78±0.46cd63.74±0.32defg22.58±2.06a93.78±0.004efG11赤霞珠MRS365.52±12.05def199.23±12.12hij57.50±0.73def57.73±1.26hijk13.74±2.20hijk99.59±0.034eG16公酿1号RR347.87±19.14efg339.72±18.87f52.57±1.04hij71.54±0.98bc16.50±1.52defg73.48±0.016jklmG17公主白MRR131.53±9.84k472.87±30.09e50.99±1.62ijk45.12±1.55no15.81±1.16defgh113.02±0.078dG19寒香蜜无核MRR336.25±15.60fg246.15±14.47ghi29.81±0.81p61.01±1.87fghi13.24±2.07ijkl48.87±0.024pG21河岸葡萄MRR326.53±37.01fgh172.91±10.15ijk47.63±1.09kl74.92±2.01b9.90±1.69mno63.58±0.031lmnoG34金星无核RHR250.90±18.10ij183.79±14.77hij26.24±1.06q48.86±2.06mn14.02±1.44hijk53.70±0.035nopG37京玉SHS408.50±15.10cd299.54±19.21fg63.73±0.22b64.70±0.58def11.27±0.61lmn98.49±0.008eG40巨峰MRR378.73±8.71def195.03±11.45hij68.23±1.22a50.40±3.32mn15.27±2.62efghi135.38±0.089abG41巨玫瑰MRR549.19±20.03a183.66±16.66hij49.78±0.49jkl61.98±0.81efgh11.77±1.00klm80.31±0.003ghijG42康可RHR226.30±7.26j63.05±1.75bc48.88±1.29mn9.29±0.98no128.98±0.064bcG47老君山桦叶MRHS332.27±5.28fgh149.49±3.47kl58.95±1.08d64.66±2.70def17.01±1.93cdef91.17±0.049efgG57蜜汁MRR422.65±10.14bcd233.59±20.89ghij59.54±0.58cd64.72±1.31def19.41±0.68b91.99±0.029efG61秦岭桑叶MRHR367.53±12.46def54.27±0.20fghi39.57±1.68p18.83±0.53bc137.15±0.068abG63沙地葡萄SR466.96±11.99b211.65±6.61hijk55.16±1.31efgh71.17±1.03bc15.19±1.82fghi77.50±0.012hijkG65沈农硕丰RR80.51±4.21k586.24±3.78cd40.14±1.16mno53.35±1.86klm17.96±0.74bcd75.25±0.087hijklG66沈农香丰RMR278.73±3.12hij249.66±41.13gh38.90±0.99no58.93±1.01ghij19.57±0.51b66.00±0.039klmnG68双丰HRR395.96±9.37cde203.67±37.45hij58.34±1.65de43.14±1.31op17.57±2.50bcde135.24±0.033abG69双红HRR579.93±4.66a205.98±16.64hij40.92±1.02mn53.85±1.96jklm15.30±2.24efghi75.99±0.032hijklG70双庆HRR84.62±22.41k207.59±6.39hij66.51±0.74ab45.61±1.00no12.73±1.47jkl145.79±0.025aG71双优HRHR103.19±43.57k864.20±12.11b32.23±1.48p52.12±0.57lm12.17±1.87jkl61.83±0.031noG76甜冬葡萄HRR95.59±3.28k643.82±39.28c69.32±0.23a56.50±1.89ijkl8.39±1.85o122.68±0.026cdG79无核白鸡心HSHS235.78±7.56j568.61±36.70cd38.15±0.25no81.01±0.60a16.97±2.70cdef47.09±0.003p28 沈阳农业大学硕士学位论文续上表白腐病22材料编号材料名称灰霉病抗性气孔面积(μm)单位面积气孔(个/mm)栅栏组织厚度（μm）海绵组织厚度（μm）上表皮厚度（μm）栅海比%抗性PalisadetissueMaterialMaterialWhiterotB.cinereaStomatalareaperPalisadetissueSpongytissueUpperepidermisStomatalareathickness/SpongynumbernameResistanceResistanceunitareathicknessthicknessthicknesstissuethicknessG85香悦RR322.55±12.25fgh286.13±9.63fg53.50±1.30ghi68.68±5.09cd19.45±7.09b77.90±0.035hijkG88信阳华东MRS234.86±8.66j101.68±6.03lm47.15±0.67l53.39±0.96klm22.42±0.95a88.30±0.024efghG90意大利SHS128.71±3.21k1133.85±59.72a52.98±0.91ghij60.75±1.70fghi12.12±1.60jkl87.21±0.037efghiG94着色香RHR374.80±14.10def234.03±21.23ghij37.04±0.85o49.57±0.87mn14.46±1.84ghij74.73±0.023ijklmG97醉金香MRMR566.21±34.81a46.34±2.57mn54.99±2.96efgh85.59±1.81a12.65±3.03jkl64.24±0.035lmnG101左优红HRR100.63±6.15k832.23±36.18b56.48±0.63defg66.70±1.05cde13.28±1.75ijkl84.67±0.016fghijHR：高抗，R：抗病，MR：中抗，S：感病，HS：高感；小写字母为显著性差异（P<0.05）HR:Highlyresistant,R:Resistant,MR:Middleresistant,S:Susceptible,HS:Highlysusceptible.Lowercaselettersaresignificantdifferences.（P<0.05）29 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究3.3.3葡萄叶片受侵染后过氧化氢酶(CAT)活性的影响从表3-4和图3-3可以看出，健全叶的CAT活性均值随抗病性的增加而上升。白腐病的感病叶CAT活性也随抗病性的增加而上升，且CAT活性分布范围在162.52-569.73unit.min-1.g-1之间。抗病性较高的品种CAT活性升高幅度较大，抗病性较差的品种则升高幅度较低或降低。从图3-3可以直观看出健全叶片的CAT活性值(C)的离散程度大于染病后的叶片酶活性(A)，染病后各抗性类别CAT活性重叠部分较小，而健全叶重合部分较多。灰霉病的感病叶CAT活性95.56%高于健全叶的活性值，且随抗病性的增加而上升。高抗品种金星无核为444.01unit.min-1.g-1、康可为496.38unit.min-1.g-1、秦岭桑叶为512.14unit.min-1.g-1、双优为463.22unit.min-1.g-1和着色香为476.73unit.min-1.g-1。感病叶CAT活性整体高于其它（除部分抗病品种）抗性类别的酶活值，与感病品种红地球184.08unit.min-1.g-1、京玉219.30unit.min-1.g-1、老君山桦叶260.89unit.min-1.g-1、瓶儿葡萄177.33unit.min-1.g-1、无核白鸡心222.72unit.min-1.g-1、香妃203.68unit.min-1.g-1和意大利205.07unit.min-1.g-1有显著性差异（P<0.05）。30 沈阳农业大学硕士学位论文表3-4不同葡萄品种叶片接种前后CAT活性对比Table3-4CATactivityinleavesofdifferentgrapespeciesbeforeandafterinoculationCAT活性(unit/min/g)CATactivity接种灰霉病接种白腐病材料编号健全叶灰霉病抗性白腐病抗性InoculationB.cinereaInoculationwhiterotMaterialHealthyB.cinereaWhiterotnumberleafResistanceResistance感病叶酶活性变化感病叶酶活性变化SusceptibleleafEnzymechangeSusceptibleleafEnzymechangeG1222.81SHS289.1666.35182.06-40.75G4303.03SS341.8738.84226.89-76.14G7342.23RMR418.0175.78317.00-25.24G9202.17SS241.2939.13197.70-4.46G11281.80SMR316.2534.46280.78-1.02G16424.78RR484.0759.29421.35-3.43G17374.90RMR402.1827.28290.56-84.34G19410.17RMR436.1726.00291.71-118.46G21435.69RMR435.690.00374.48-61.20G22352.43RMR432.9580.53276.19-76.23G25173.42HSHS184.0810.66165.05-8.37G34402.20HRR444.0141.81403.931.74G36385.65RS432.3846.73291.00-94.65G37207.79HSS219.3011.51236.7528.96G40348.62RMR365.5916.97339.60-9.02G41348.83RMR371.4122.58350.771.94G42428.81HRR496.3867.57471.5642.75G47200.65HSMR260.8960.25203.773.13G50287.54MRMR339.9052.36303.3015.76G53297.96SS298.340.38228.30-69.65G57339.72RMR383.4643.74344.704.98G58154.08HSHS177.3323.25172.0818.00G61486.87HRMR512.1425.27398.69-88.18G63309.39RS365.8956.50285.84-23.55G64323.74RMR339.5515.81350.5326.79G65335.57RR348.8113.24370.1634.59G66339.34MRR339.340.00421.1881.85G67291.36RMR382.5191.15286.90-4.46G68403.32RHR442.4439.12516.29112.97G69437.30RHR459.7222.42470.8433.5531 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究续上表CAT活性(unit/min/g)CATactivity材料编号健全叶灰霉病抗性白腐病抗性接种灰霉病接种白腐病MaterialHealthyB.cinereaWhiterotInoculationB.cinereaInoculationwhiterotnumberleafResistanceResistance感病叶酶活性变化感病叶酶活性变化SusceptibleleafEnzymechangeSusceptibleleafEnzymechangeG70332.96RHR369.9737.01390.3157.35G71404.39HRHR463.2258.83569.73165.35G73275.56SS262.13-13.43252.99-22.58G74355.02RR382.3727.36385.0830.06G76368.08RHR380.4612.38487.43119.35G79206.73HSHS222.7215.99162.52-44.21G83304.47RR361.9357.46357.0952.61G84194.35HSHS203.689.33177-17.35G85358.47RR370.9112.44375.717.23G88242.9SMR257.5614.66279.4636.56G89318.12MRMR335.9417.81324.065.94G90188.41HSS205.0716.66205.2916.88G94454HRR476.7322.73517.0363.03G97294.36MRMR316.9122.55297.112.76G101312.61RHR405.1792.57444.5131.9HR：高抗，R：抗病，MR：中抗，S：感病，HS：高感HR:Highlyresistant,R:Resistant,MR:Middleresistant,S:Susceptible,HS:Highlysusceptible32 沈阳农业大学硕士学位论文图3-345份葡萄品种CAT酶活性范围及其分布Fig.3-3TherangeanddistributionofCATenzymeactivityin45grapevarieties注：图AB均为感病叶片的酶活性，其中A为白腐病，B为灰霉病；图CD均为健全叶片的酶活性，其中C为白腐病，D为灰霉病.Note:FigureABistheenzymeactivityofsusceptibleleaves,ofwhichAiswhiterot,Bisgraymold;FigureCDaretheenzymeactivityofhealthyleaves,inwhichCiswhiterot,Disgraymold.3.3.4葡萄叶片受侵染后过氧化物酶(POD)活性的影响从表3-5和图3-4可以看出，健全叶的POD活性均值随抗病性的增加而上升。感病叶POD活性也随抗病性的增加而上升，其中中抗（MR）、抗病（R）和高抗（HR）POD活性值较为接近，感病（S）与高感（HS）更为相近。侵染灰霉菌后，95.56%叶片POD活性整体高于原健全叶。（除金星无核、老君山桦叶和香妃葡萄）高抗白腐病（HR）品种中染病叶片的POD活性与感病（S）、高感（HS）品种染病有显著性差异，（P<0.05），健全叶片中POD活性最高的为老君山桦叶，显著（除双优）高于其它品种（P<0.05），活性为249.14unit/min/g，高感无核白鸡心POD活性最低为21.44unit/min/g。侵染白腐菌后的叶片大部分POD活性呈上升趋势，如高抗白腐病的品种金星无核、康可和着色香，分别为197.51unit/min/g、208.51unit/min/g和211.97unit/min/g，高感品种意大利36.08unit/min/g、无核白鸡心27.88unit/min/g、红地球34.47unit/min/g和瓶儿41.09unit/min/g。33 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究表3-5不同葡萄品种叶片接种前后POD活性对比表Table3-5PODactivityinleavesofdifferentgrapespeciesbeforeandafterinoculationPOD活性(unit/min/g)PODactivity材料编号灰霉病抗性白腐病抗性接种灰霉病接种白腐病健全叶MaterialB.cinereaWhiterotInoculationB.cinereaInoculationwhiterotHealthyleafnumberResistanceResistance感病叶酶活性变化感病叶酶活性变化SusceptibleleafEnzymechangeSusceptibleleafEnzymechangeG123.02HSS35.3312.3043.0820.06G461.33SS79.4618.1362.941.61G7131.47MRR151.6120.15217.8786.41G949.87SS80.8630.9969.7619.89G1190.29MRS153.3263.03101.8111.52G16114.70RR194.1779.47122.878.17G1765.39MRR139.9274.54192.58127.20G1957.36MRR163.09105.74184.87127.52G21102.32MRR152.5650.23208.25105.92G2270.26MRR113.2843.03175.02104.76G2526.52HSHS35.178.6534.477.96G34173.86RHR169.25-4.61197.5123.65G3640.65SR70.7130.06105.5764.92G3749.48SHS75.4325.9590.7841.30G40120.05MRR176.0556.00145.7725.72G41158.06MRR185.8627.81161.933.88G42182.95RHR265.2482.29208.5125.56G47249.14MRHS162.06-87.0979.39-169.75G5087.45MRMR130.2042.75143.7956.33G5341.05SS62.1521.1053.3612.31G57175.15MRR242.6767.52143.16-31.99G5831.61HSHS25.77-5.8441.099.48G6199.55MRHR145.5145.96170.4870.93G6332.27SR49.5017.23178.84146.57G6477.59MRR127.3549.76133.2555.66G65134.55RR224.0089.45154.7620.21G66118.46RMR200.3181.85122.213.74G6735.86MRR140.45104.59149.89114.03G68147.81HRR223.5975.78136.10-11.71G69145.66HRR238.2292.57173.4927.8434 沈阳农业大学硕士学位论文续上表POD活性(unit/min/g)PODactivity材料编号健全叶灰霉病抗性白腐病抗性接种灰霉病接种白腐病MaterialHealthyleafB.cinereaWhiterotInoculationB.cinereaInoculationwhiterotnumberResistanceResistance感病叶酶活性变化感病叶酶活性变化SusceptibleleafEnzymechangeSusceptibleleafEnzymechangeG70142.9HRR202.1959.29164.1221.22G71121.85HRHR216.0494.19234.6112.75G7344.95SS71.4426.4961.0316.08G74116.51RR200.583.99139.3922.88G76151.37HRR256.31104.94219.6968.32G7921.44HSHS31.5910.1427.886.43G83111.58RR195.7484.16154.3142.73G8473.45HSHS52.8-20.6565.49-7.96G85118.81RR202.6983.88139.3120.5G88116.06MRS167.6651.61106.29-9.77G8985.67MRMR142.2456.5799.5913.92G9042.35SHS67.5825.2336.08-6.27G94102.95RHR209.24106.29211.97109.02G9766.15MRMR148.7682.6186.6720.52G101111.52HRR212.67101.15189.9878.47HR：高抗，R：抗病，MR：中抗，S：感病，HS：高感HR:Highlyresistant,R:Resistant,MR:Middleresistant,S:Susceptible,HS:Highlysusceptible35 葡萄品种资源抗病相关形态和生理研究图3-445份葡萄品种POD酶活性范围及其分布Fig.3-4TherangeanddistributionofPODenzymeactivityin45grapevarieties注：图EF均为感病叶片的酶活性，其中E为白腐病，F为灰霉病；图GH均为健全叶片的酶活性，其中G为白腐病，H为灰霉病.Note:FigureEFistheenzymeactivityofsusceptibleleaves,ofwhichEiswhiterot,Fisgraymold;FigureGHaretheenzymeactivityofhealthyleaves,inwhichGiswhiterot,Hisgraymold.3.4讨论3.4.1葡萄抗病性与葡萄叶片显微结构的关系本试验研究了抗病性与葡萄叶片结构，如气孔大小、气孔密度和栅栏组织厚度等显微结构的相关性。现阶段葡萄病害逐渐以叶片进行抗病鉴定，幼叶为灰霉菌主要侵染对象之一(HolzGütschowetal.,2003)，通过对叶片进行相关病害鉴定，可早期确定该品种的抗病类型。刘天明（1999）和李宁枫（2016）研究得出不同葡萄品种对霜霉病的抗性与叶背气孔密度、气孔大小无显著性相关。景岚（2009）在向日葵品种叶片中发现其栅栏组织厚度与和抗锈病抗性呈正比，而气孔密度和气孔大小无关。本研究结果表明灰霉病的抗病性仅与海绵组织厚度有关，与气孔大小及气孔密度均无显著性相关，这与前人研究结果相似，本试验还发现白腐病抗性不仅与海绵组织厚度有关还与气孔大小有关，分析原因可能是由于不同真菌性病害之间存在差异造成的。由上述结果可看出海绵组织厚度与抗性有重要关系，可作为判断葡萄抗病（白腐病、灰霉病）能力强弱的一种鉴定方式。36 沈阳农业大学硕士学位论文3.4.2葡萄抗病性与酶活性（CAT/POD）的关系以对白腐病和灰霉病有不同抗病类型的45个葡萄品种为对象，测定侵染白腐病和灰霉病前后的防御酶（CAT/POD）活性值。研究表明不同抗性品种间防御酶活性的变化规律存在差异。近年来防御酶活性变化与抗性间的关系受到密切关注。PerepelistaED研究得出的抗性低的品种CAT活性变化幅度较小，抗性高的品种CAT活性上升幅度较大，而未感病叶片CAT活性与抗病性无关。本研究发现抗白腐病性较高的品种CAT活性升高，而抗病性较差的品种则升高幅度较低或降低，这与前人所得结论一致。本试验发现健全叶的CAT活性也与抗性存在联系，分析原因可能为本研究中的对照为与染病叶片同等条件下培养后，同期进行取样保存，从而使离体后的叶片可能产生胁迫现象，使得其中的防御应激酶CAT也进行了抵制作用。杨国顺（1990）和吴岳轩等人（1996）均得出品种抗病性越高，POD活性越高，即成正比的结论（Joseph,1998）。李宁枫（2013）对7个葡萄品种进行POD活性与抗性分析，得出抗性品种活性高于感病品种。本研究结果表明，健全叶和感病叶（白腐病、灰霉病）的POD活性均值随抗病性的增加而上升，本结论与前人所得结论一致。研究发现侵染白腐病菌中健全叶片的CAT活性值(C)的离散程度大于染病后的叶片酶活性(A)，染病后各抗性类别CAT活性重叠部分较小，而健全叶重合部分较多。感灰霉病POD活性变化与其相似。李妙（1993）等对不同抗枯萎类型棉花研究，发现感病品种的超氧物歧化酶和过氧化物酶均比未感病品种含量高。王玲平等人（2001）研究发现对抗枯萎病菌抗病性强的品种SOD、POD活性均明显高于感病品种。万然（2016）对葡萄进行POD活性与抗性分析，得出抗性品种活性高于感病品种，抗性较高的品种POD活性升高，而抗病性较差的品种则升高幅度较低或降低。本研究结果与前人所得结论一致。但在未感病的健全叶片中的结论有较大差异分析原因可能是本研究中的对照为与染病叶片同等条件下培养后，同期进行取样保存，从而使离体后的叶片可能产生胁迫现象，使得其中的防御应激酶POD也进行了抵制作用。总体上可以得出CAT、POD与葡萄抗病性存在重要联系，可以作为葡萄抗性鉴定（白腐病、灰霉病）的一种辅助标准。37 结论4结论（1）通过对101份不同葡萄品种叶片进行抗白腐病鉴定，可看出鉴定结果差异明显。共筛选出了高抗（HR）材料9份，抗病（R）材料17份，中抗（MR）材料44份，感病（S）材料24份和高感（HS）材料7份。（2）灰霉菌孢子的鉴定结果，可以看出，101份品种中高抗（HR）材料8份，抗病（R）材料43份，中抗（MR）材料12份，感病（S）材料28份和10份高感（HS）材料。（3）综合101份葡萄品种叶片抗白腐病及抗灰霉病鉴定结果，可得出高抗品种双优，抗病品种公酿1号、沈农硕丰、藤稔、香悦和左山二等。（4）对不同抗病类型的30份葡萄品种进行叶片显微结构观察，可分析出白腐病抗性与气孔大小及海绵组织厚度有关；灰霉病抗性仅与海绵组织厚度有关。（5）根据45份不同抗病类型葡萄品种的酶活性测定。得出葡萄品种抗性和CAT、POD活性呈正相关性。38 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致谢致谢求学的日子总是过得十分短暂，两年的时光换得一辈子的回忆，和那已成为记忆的知识将伴随我迎接未知的生活。对老师和朋友们有着难以言表的依恋，对生活过的每一寸土地都有着不舍。即将走出校园的我向所有关心、帮助过我的人们以及给予了我美好的研究生生活的沈农表示最诚挚的感谢。我首先要感谢我的导师赵玉辉老师，本论文是在她的悉心指导下完成的。她与郭印山老师从我的选题再到撰写和修正，定稿都倾注了他们的心血。在学习和生活上对我给予了许多关心和帮助，并鼓励我不断的完善自己，充实自己。我还要感谢蔡之博老师在校外对我的耐心指导。我要向恩师们致以最衷心的感谢和送上我最崇高的敬意，祝老师身体健康，工作顺利，家庭幸福！感谢董文轩老师、郭修武老师、刘镇东老师、李坤老师、侯亚莉老师、张枭老师和王洪玉老师在本次试验过程中给予的帮助和耐心的指导。感谢园艺学院果树学科吕德国老师，张志宏老师，王爱德老师，秦嗣军老师，李贺老师，代汉萍老师等所有老师，感谢您们给予我的指点和帮助。衷心祝各位老师们身体健康，事事顺利！由衷感谢我的刘倩文师姐，张军辉师兄帮助设计课题思路，以及与好友赵佳，任志华和我的男朋友张晓亮同学在试验阶段和日常学习生活中给予的帮助及支持；感谢苏凯师兄、寇刚师兄、万会雪师姐、孙鑫师姐、马霞霞师姐、赵雨师弟、王玲玲学妹、蒋文浩、苏洋洋、高宏艳、赵亚雪、牛刘静等在试验上给予的帮助和生活上的关心。感谢我的室友商叶，赵佳和尹娇阳对我生活的帮助并给予试验中的鼓舞。感谢爸爸妈妈多年来的宠爱与教育，给予的耐心和包容。真的谢谢你们给我的鼓励和支持，让我无所畏惧的前行！以后我会慢慢回报你们对我那无私的关爱。最后，感谢此次评阅本文和参与答辩的各位专家和老师！辛苦您啦！刘丽婷2018年6月46 论文图表统计:计：学位论文46页表格9个插图11幅
