尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用

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第二军医大学博士学位论文尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用Urine-derivedstemcellsforthetreatmentofchronickidneydiseaseinaratmodel研究生姓名：张超指导老师：孙颖浩教授学科、专业：外科学泌尿外科专业学位类型：医学博士学位培养单位：第二军医大学附属长海医院答辩日期：2014年5月二○一四年五月 目录中文摘要..................................................1英文摘要..................................................3缩写词表..................................................6前言..................................................7第一部分尿源干细胞的分离和鉴定..........................11第二部分尿源干细胞的组织相容性研究......................25第三部分尿源干细胞治疗慢性肾病的研究....................42全文结论.................................................61文献综述.................................................67在读期间完成的论文.......................................78致谢.................................................79 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用摘要背景：慢性肾病是一种可以导致尿毒症和心血管系统并发症的常见疾病，且发病率一直处于上升趋势。全世界慢性肾病患者约占总人口的13%，使之成为一个重大的公共卫生问题。我国慢性肾病的流行病学也不容乐观，慢性肾病患者约占总人口的10.25%左右，且发病率逐年升高。慢性肾病为进展性疾病，可发展至终末期肾病，给患者身体上及心理上造成巨大的创伤。与此同时，随之而来的经济负担也十分沉重。2007年，仅美国的终末期肾病支出就高达230多亿，占其全部医疗支出的5.8%。目前对于终末期肾病的治疗手段仍十分有限，主要依赖透析和肾移植。透析成本高昂、并发症多、且降低患者的生活质量。此外，透析仅仅替代肾脏的滤过功能，而不能替代其内分泌等功能。另一方面，供体的短缺严重制约了肾移植的开展，且免疫排斥和免疫抑制药物对患者造成的影响也难以解决。因此，临床上需要新的治疗慢性肾病的手段。细胞疗法近年来逐渐受到重视，尤其在干细胞方面，由于其强大的自我更新和多向分化能力，在各个研究领域均取得了长足的进展。尿源干细胞是一种新的干细胞来源，属于间充质干细胞，可从新鲜尿液中获取，其获取手段无创，可反复收集从而得到大量的起始细胞。间充质干细胞对肾功能有改善作用，而尿源干细胞最可能的来源是肾脏，组织来源上的优势使之可能对肾功能具备更明显的改善作用。研究目的：研究尿源干细胞是否对慢性肾病具有治疗作用，并初探其机制。研究方法：1.从健康供体新鲜尿液中提取尿源干细胞，通过自我更新能力、多向分化能力、表面标志物情况对尿源干细胞进行鉴定和确认。2.向裸小鼠肾脏中注射尿源干细胞，在注射细胞1周、2周、3周、4周后处死小鼠、收集肾脏，观察尿源干细胞的分布情况，并通过观察其表面标志物的表达情况初探其分化为肾脏细胞的可能性。3.实验动物分为3组，第一组为年龄匹配的正常对照，第二组为接受注射尿源干细胞的慢性肾病大鼠模型，第三组为注射磷酸盐缓冲液的慢性肾病大鼠模型，通过对其血清肌酐、肾小球滤过率的随访判断尿源干细胞对肾功能的改善作用，并对3组肾脏进行组织形态学的评估。‐1‐ 第二军医大学博士学位论文结果：1.新鲜尿液中获得的细胞克隆可自我更新，能够分化成为脂肪细胞和骨细胞。尿源干细胞表达间充质干细胞的表面标志物：CD24、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146等；不表达造血细胞表面抗原：CD31、CD34、CD45等。2.尿源干细胞可以在肾脏组织内存活，在有限的随访时间内，显微镜下未发现与肾脏组织结构的融合，且尿源干细胞始终表达间充质干细胞的表面抗原，分化的可能性较小。3.尿源干细胞对肾功能具有改善作用，相较于注射磷酸盐缓冲液的对照组，注射尿源干细胞的动物模型血清肌酐降低、肾小球滤过率升高。尿源干细胞对肾脏的组织学形态有改善作用，相较于注射磷酸盐缓冲液的对照组，注射尿源干细胞的动物模型健康肾单元的数量增加、一型胶原和三型胶原数量减少、肾脏间质炎性细胞浸润减轻。结论：尿源干细胞可能对慢性肾病患者的肾功能有改善作用，可能成为无创的、自体的治疗慢性肾病的新的细胞来源，其作用机制和优化的治疗手段仍需要进一步的研究。关键词：尿源干细胞，细胞疗法，慢性肾病，缺血再灌注损伤‐2‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用AbstractBackground:Chronickidneydiseaseisacommondiseasethatmayleadtouremiaandcardiovascularcomplications,anditsincidenceratehasbeenontherise.Approximately13%oftheworldpopulationaresufferingfromchronickidneydisease,makingitamajorhealthcareproblem.Inourcountry,theincidencerateofchronickidneydiseaseisalsohigh,affecting10.25%ofthepopulation.Chronickidneydiseaseisprogressive.Itmayfinallybecomeend-stagerenaldisease,whichwillbringabouthugeeconomicburden.In2007alone,theexpenditureofUnitedStatesonend-stagerenaldiseasewasalmost23billionUSdollars,accountingfor5.8%oftotalMedicarebudget.Currenttreatmentsagainstend-stagerenaldiseasearelimited.Dialysisandrenaltransplantationarethemosteffectivemethods.However,dialysisisalongprocedurewithmanycomplicationsthatwilldecreasepatients’qualityoflife.Moreover,itonlyreplaceskidney’sfiltrationfunctionandcannotreplacetheendocrinalfunctionandsoon.Ontheotherhand,thebiggestobstacleofrenaltransplantationistheshortageofdonororgans.Furthermore,theproblemoftissuerejectionandtheconsequencesofimmunesuppresscannotbeeasilysolved.Therefore,newtherapiesareneeded.Celltherapyhasbeenattractinggrowinginterests.Stemcells,becauseoftheirabilitiestoself-renewanddifferentiateintodifferentkindsofcells,havemadepromisingprogressinalmosteveryresearchfield.Urine-derivedstemcellsareanewsourceofstemcells.Theybelongtothemesenchymalstemcellfamily,andcanbederivednon-invasivelyfromfreshurine.Mesenchymalstemcellsmaybebeneficialforrenalfunctions.Becauseurine-derivedstemcellsmaycomefromkidneys,itmaybeabettercellsourcetotreatchronickidneydisease.Purpose:Tostudywhetherurine-derivedstemcellscantreatchronickidneydiseaseandtobrieflydiscussthemechanisms.Methods:1.Urine-derivedstemcellswereharvestedfromhealthdonors.Cellswerecharacterizedthroughtheabilitiesofself-renewandmultipotentdifferentiation,aswellastheexpressionofsurfacemarkers.‐3‐ 第二军医大学博士学位论文2.Urine-derivedstemcellswereinjectedintothekidneysofathymicmice.Themiceweresacrificedat1-week,2-week,3-week,and4-weektimepoints.Thekidneyswereharvested,andurine-derivedstemcellswerelocatedbyantibodies.Surfacemarkersweretestedtoseethepossibilityofrenaldifferentiation.3.Athymicratsweredividedinto3groups:age-matchedcontrolgroup,chronickidneydiseasemodelsinjectedwithurine-derivedstemcells,andchronickidneydiseasemodelsinjectedwithphosphatebufferedsaline.Renalfunction,includingserumcreatinineandglomerulusfiltrationrate,ofthe3groupswerefollowed.Thehistologicalevaluationofthekidneysofthe3groupswerealsoperformed.Results:1.Urine-derivedcellcloneswereabletoself-renew,anddifferentiateintoosteocytesandadipocytes.ThesecellsexpressmesenchymalstemcellsmarkerssuchasCD24,CD29,CD44,CD73,CD90,CD105,CD146,andsoon.Ontheotherhand,theydonotexpresshematopoieticmarkerssuchasCD31,CD34,andCD45.2.Urine-derivedstemcellssurvivedinsidethekidney.Withinthelimitedtimeoffollow-up,nocellfusionwasobservedundermicroscope.Urine-derivedstemcellsstillexpressedmesenchymalstemcellsmarkersmeaningthattheymaynotdifferentiateintorenalcells.3.Urine-derivedstemcellsmayimproverenalfunctions.Comparedwithmodelsinjectedwithphosphatebufferedsaline,modelsinjectedwithurine-derivedstemcellshadlowerserumcreatininelevelsandhigherglomerulusfiltrationrates.Urine-derivedstemcellsmayimprovethestructureofkidneyaswell.Comparedwithmodelsinjectedwithphosphatebufferedsaline,modelsinjectedwithurine-derivedstemcellshadmorehealthynephrons,decreasedtypeIandtypeIIIcollagen,andlessinflammatoryfiltration.Conclusions:Urine-derivedstemcellsmayanalternativetreatmentmethodforchronickidneydisease.Thesecellscanbederivedfromfreshurineandmaybeanon-invasive,autologouscellsourcetotreatchronickidneydisease.Themechanismsneedsfurtherstudying,andmodifiedtreatmentplansareneeded.‐4‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用KEYWORDS:Urine-derivedstemcells,celltherapy,chronickidneydisease,ischemia-reperfusioninjury.‐5‐ 第二军医大学博士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文名称USCUrine-derivedstemcell尿源干细胞PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜rpmRevolutionsperminute转/分钟GFPGreenfluorescenceprotein绿色荧光蛋白FBSFetalbovineserum胎牛血清HLAHumanleukocyteantigen人类白细胞抗原VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子siRNASmallinterferingRNA小干扰RNAGFRGlomerularfiltrationrate肾小球滤过率AMCAge-matchedcontrol年龄匹配的对照‐6‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用前言2002年，美国肾脏基金会在其临床指南中将肾脏损伤或肾小球滤过率持续低于2160mL/min/1.73m超过3个月的情况定义为慢性肾病。我国慢性肾病患者约占总人口的210.25%左右，且发病率呈逐年上升趋势。在美国，目前约有2700万慢性肾病患者，罹3,4患率从20世纪90年代的10.0%上升到21世纪初的13.1%。随着当代医学的发展，心血管疾病和糖尿病治疗水平的提高，更多的病人得以长期存活，并发展成为慢性肾病；此外，肥胖患者日益增多也导致了慢性肾病患者数量的增加。有统计推测，在10年内，4,52慢性肾病患者的数量将翻倍。肾小球滤过率低于15mL/min/1.73m或需要透析的状态1为终末期肾病，肾脏的滤过功能和内分泌功能均受到极大的损害。目前，针对终末期肾病的主要方法仍然只有透析和肾移植。小分子物质可跨过半透膜，扩散到半透膜另外一侧的缓冲液中，透析技术利用此原理，将小分子代谢产物与人体所需的生物大分子物质区分开来，从而排出代谢产物，维持体内水电解质平衡和酸碱平衡。临床上应用的透析技术主要由两种：血液透析与腹膜透析。然而，透析过程繁冗，代价高昂，严重降低患者的生活质量，且不论何种透析技术，均主要替代肾脏的滤过功能，肾脏的内分泌功6,7能需要其它手段替代。另一方面，肾移植可能全面的替代肾功能，然而肾源的不足极8大的限制了肾移植的发展，目前的供体数量仅满足约五分之一的需求。接受肾移植的9患者需要长期服用免疫抑制剂以减轻排异反应，降低了患者免疫力，同时提升了患者的肿瘤风险。除了肾脏功能本身的损害，慢性肾病可导致继发的心血管系统疾病（目前10研究发现，即使肾小球滤过率有少量的下降，也可能引起明显的心血管事件增加）、血液系统疾病、神经肌肉系统症状以及胃肠道症状。因此，慢性肾病已成为我国乃至全世界重大的生命健康问题，急需创新型的、有效的治疗方法。适当的动物模型是研究慢性肾病机制以及开发治疗手段的基础。部分肾切除是最常见的慢性肾病造模方法，通常实验动物的一侧肾脏被切除，对侧肾脏切除三分之二或六11分之五。临床上的慢性肾病多为系统性疾病，糖尿病肾病被认为是慢性肾病最常见的12原因，由于肾切除造模方法导致的肾脏损伤不是系统性疾病，因此不能很好的对慢性肾病的临床特征进行模拟。药物也是造模常用的方法，顺铂、庆大霉素等肾毒性药物均13,14得到了一定的应用，但长期随访发现单纯使用药物时肾功能较易恢复，慢性模型成功率较低。药物造模因操作简单，可重复性较好，在急性肾病模型中得到了更加广泛的应用。短暂肾脏缺血常常导致急性肾功能不全，大部分病人在缺血恢复后，肾功能可恢复至正常水平；当缺血时间较长时，肾功能的损害可能更加持续。在此理论基础上，15Wang等研究了双侧肾脏缺血对大鼠肾功能的影响。他们通过夹闭大鼠双侧肾动脉造成肾脏缺血，随后开放动脉造成缺血-再灌注损伤，不同组大鼠的缺血时间分别为：双‐7‐ 第二军医大学博士学位论文侧60分钟，60/75分钟，60/90分钟，双侧75分钟，75/90分钟以及无缺血对照。通过缺血后12周的随访，他们发现双侧动脉夹闭60分钟可有效的造成长期肾脏损伤，且大鼠术后死亡率较低，成模率高。随后，Yamaleyeva等将缺血-再灌注损伤和肾毒性药物16庆大霉素同时应用。首先通过双侧肾动脉阻塞60分钟导致缺血-再灌注损伤，术后2周起，连续5天皮下注射庆大霉素以加重肾脏损害，从而得到了更加稳定的慢性肾病模型。啮齿类动物作为动物模型有一定优势：1）体积小，单位面积内可以养殖较多小鼠17或大鼠。2）繁殖周期短，近亲交配可形成特定的种系。3）成本较低。因此，啮齿类动物的慢性肾病模型目前应用最为广泛。然而，新型治疗手段要应用到临床，最理想的18模型是灵长类动物。该类动物模型成本高、技术难度大，且存在更多的伦理问题，因19此当慢性肾病治疗手段进展到临床前的转化阶段时，多采用哺乳动物。近年来，细胞疗法在治疗肾病中的作用越发得到重视，内源性原代细胞、成人干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞等众多种类的细胞均在肾脏疾病取得了13,16,20-22一定的进展和成果。肾脏原代细胞被发现对肾功能有改善作用。研究者将获取的原代细胞在体外扩增后注射入慢性肾病动物模型的肾脏，发现细胞注射过动物肾功能16有所恢复，尿白蛋白减少，肾脏组织纤维化以及炎性细胞浸润的情况好转。随着干细胞技术的不断发展，越来越多的干细胞出现在针对慢性肾病的细胞疗法中，并逐渐开始向临床前期过渡。目前，间充质干细胞对慢性肾病的治疗作用研究较多。骨髓来源的间20充质干细胞被通过尾静脉注射入慢性肾病的小鼠模型中，相比对照组，接受细胞注射的小鼠肾脏功能提升、结构改善，间质纤维化程度以及炎性细胞浸润程度均有明显的减轻，血管内皮生长因子表达增多。相似的结果在脂肪来源的间充质干细胞中也可观察到23。有学者采用猫的慢性肾病模型研究脂肪来源的间充质干细胞治疗慢性肾病的安全性19和副作用进行了研究，为间充质干细胞向临床的转化提供理论依据。24组织特异性干细胞和祖细胞几乎存在于所有的组织和器官内。尿源干细胞来源于25泌尿系统，每100ml新鲜尿液中能获得尿源干细胞克隆约7-8个。这些细胞表达间充质干细胞的表面抗原，大多数尿源干细胞克隆端粒酶呈阳性，能够倍增60-70次，且在26适当的诱导条件下能于体外分化成为一系列不同种类的细胞。尿源干细胞分化成为尿27路上皮细胞、平滑肌细胞的技术已经比较成熟，可用于膀胱等泌尿系统器官的重建。由于尿源干细胞与骨髓来源以及脂肪来源等间充质干细胞特性类似，因此可能对肾功能26也存在改善作用。而且，由于其最可能的来源是肾脏，相比间充质干细胞，可能对肾功能的改善作用更加明显；而相对胚胎干细胞等更加原始的细胞，对肾功能的改善可能更加直接。尿源干细胞属于自体细胞，从患者身上获取后，在体外扩增后用于细胞疗法，可以避免排异，并最大限度的降低免疫反应。尿源干细胞另一个优势来自于获取方式。25细胞可通过新鲜尿液获得，为无创手段，且尿液中细胞克隆较多，可扩增足够的细胞‐8‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用用于治疗。自体细胞的使用不存在论题问题，尿源干细胞在体内不形成畸胎瘤，提高了细胞疗法的安全性。目前，世界上尚未出现针对尿源干细胞治疗慢性肾病的研究。本文将对尿源干细胞进行分离、鉴定，利用慢性肾病大鼠模型，探讨尿源干细胞对慢性肾病模型肾功能的改善作用，并初步探索相关机制。‐9‐ 第二军医大学博士学位论文‐10‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用第一部分：尿源干细胞的分离和鉴定由于近20年来再生医学技术的不断进步，泌尿系统各个器官的再生研究也迅速发22,28-30展，各种细胞也在泌尿系统器官再生的研究中得到应用。然而，各种细胞均有着一定的局限性。内源性的原代细胞、骨髓和脂肪来源的间充质干细胞对改善肾功能有一定的作用，但此类细胞的获得需要通过穿刺等手段，获取过程为有创操作，可能造成出血、感染以及患者的不适。胚胎干细胞虽然功能强大，却是同种异体细胞，可能造成排31异反应，且胚胎干细胞的应用面临着伦理以及政策阻碍。近年来备受关注的诱导多能干细胞属于自体细胞，且避免了伦理问题，但却与胚胎干细胞一样在体内易形成畸胎瘤，且目前诱导多能干细胞的诱导效率仍较低，在肾脏再生方面的研究也刚刚起步。干细胞相比内源性的原代细胞存在一定优势。原代细胞在体内存在数量相对较少，也较难分离；而干细胞在体外的生命周期更长，在适当的诱导条件下，可以增殖和分化成为大量的用32于再生的细胞类型，并具备更强的免疫调节功能，因此在肾脏再生中的应用越来越多。在应用干细胞的同时，为了避免以上干细胞类型的局限性，尿源干细胞逐渐进入研究者的视野。人体每天排出1500ml到2500ml的尿液，其中含有多种细胞成分，因此可能成为重25要的细胞来源。Zhang等从23名供体中获得尿液标本，对尿液中不同的细胞类型进行了分离和鉴定，发现尿液中存在这样一类外观呈纺锤形的细胞，它们表达c-Kit，SSEA4，CD105，CD73，CD91，CD133以及CD44等干细胞表面的常见抗原；在培养皿中贴壁生长，并可分化为子代细胞。这些细胞当时被命名为“尿源祖细胞”。在随后的研究中发现，该类细胞能够自我更新，并能分化成为一些列的细胞类型（例如：内胚层来源的尿路上皮细胞；中胚层来源的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞；外胚层来源的神经细胞）；这些细胞表达间充质干细胞的表面抗原，不表达造血干细胞的抗原，更26名为尿源干细胞。由于和间充质干细胞特征类似，尿源干细胞可能对肾功能有恢复作用，然而目前尿源干细胞治疗肾病世界上尚未有研究。本部分将从尿液中分离干细胞，并鉴定用于后期实验。一、材料和方法：（一）材料：1、主要实验设备：‐11‐ 第二军医大学博士学位论文离心机：Eppendorf公司超净台：Baker公司细胞培养箱：Hera公司倒置显微镜：CarlZeiss公司细胞计数板：HausserScientific公司37摄氏度恒温水浴箱：Isotemp公司-80摄氏度冰箱：Sanyo公司生物安全柜：Kewaunee公司微量加样器：Eppendorf公司移液器：Propette公司流式细胞仪：BD公司2、主要实验耗材：高糖DMEM培养基：Gibco公司角质形成细胞无血清培养基：Invitrogen公司Ham’sF12培养基：Gibco公司胎牛血清：Gibco公司左旋-谷氨酰胺：Fisher公司青霉素/链霉素：Gibco公司表皮生长因子：Gibco公司霍乱毒素：Sigma-Aldrich公司氢化可的松：Sigma-Aldrich公司胰岛素：Gibco公司腺嘌呤：Sigma-Aldrich公司转铁蛋白：Sigma-Aldrich公司1L培养基过滤器：ThermoScientific公司250ml无菌尿液收集器：ThermoScientific公司无痛点消毒剂：Aplicare公司50ml离心管：Falcon公司磷酸盐缓冲液（PBS）：Sigma-Aldrich公司5ml、10ml、25ml、50ml移液管：Falcon公司微量加样枪头：Fisher公司胰酶：Gibco公司‐12‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用24孔板、6孔板：BD公司10cm培养皿、15cm培养皿：BD二甲基桠枫（DMSO）：Sigma-Aldrich公司细胞冻存管：GreinBio-One公司细胞冻存盒：实验室提供异丙醇：Fisher公司间充质干细胞分化试剂盒：BD公司，目录号SC00616%多聚甲醛：Polysciences公司丙二醇：Sigma-Aldrich公司0.5%OilRedO染色剂：实验室配置Gill’s苏木精：Sigma-Aldrich公司Scott’s自来水：Sigma-Aldrich公司AlizarinRedS染色剂：实验室配置流式细胞管：BD公司1%牛血清白蛋白溶液（1%BSA）：实验室配置TritonX-100：Sigma-Aldrich公司蛋白封闭液：Dako公司抗体稀释液：Dako公司含Dapi的封片剂：Vector公司3、主要实验抗体：Ms-IgG-FITC：BD公司，BD555909Ms-IgG-APC：BD公司，BD555751Ms-IgG-PE：BD公司，BD559320Ms-CD24-FITC：BD公司，BD560992Ms-CD29-PE：BD公司，BD555443Ms-CD31-FITC：BD公司，BD560984Ms-CD34-APC：BD公司，BD560940Ms-CD44-PE：BD公司，BD550989Ms-CD45-APC：BD公司，BD340943Ms-CD73-PE：BD公司，BD550257MS-CD90-APC：BD公司，BD561971‐13‐ 第二军医大学博士学位论文Ms-CD105-PE：BD公司，BD560839Ms-CD146-PE：BD公司，BD550315Ms-SSEA4-PE：BD公司，BD560128Ms-STRO-1-FTIC：Biolegend公司，Biolegend340105Rabbitmonoclonalanti-WT1antibody：abcam公司，ab89901Rabbitpolyclonalanti-nephrinantibody：abcam公司，ab72908Rabbitpolyclonalanti-podocinantibody：abcam公司，ab50339Goatanti-rabbitIgGantibody：vector公司，FI-1000（二）方法：1、尿源干细胞培养基的制备：成分终浓度高糖DMEM培养基35.7%角质形成细胞无血清培养基47.6%Ham’sF12培养基11.9%胎牛血清4.8%-9左旋-谷氨酰胺1*10M青霉素/链霉素1%表皮生长因子7.5ng/ml霍乱毒素15ng/ml氢化可的松0.2ug/ml胰岛素2.5ng/ml-5腺嘌呤9*10M转铁蛋白5ug/ml2、尿源干细胞的分离：本实验中尿源干细胞的分离得到维克森林大学伦理委员会的批准。（a）取20ml培养基加入250ml无菌尿液收集器；（b）消毒健康男性尿道外口，收集中段尿约200ml，分装入50ml离心管；（c）以1500rpm的速度离心5分钟，弃上清，加入PBS洗涤沉渣；（d）以1500rpm的速度离心5分钟，弃上清，加入24ml培养基；‐14‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用（e）吹打混匀后，将细胞悬液加入24孔板（1ml/孔）；（f）将24孔板放入37摄氏度、CO2浓度5%的细胞培养箱，静置48小时；（g）此后隔天换液，观察尿源干细胞克隆的形成；（h）选取细胞数约200的单细胞克隆，加入胰酶消化，传代至6孔板；（i）细胞在6孔板长满后，可传代至10cm或15cm培养皿，供实验使用。3、尿源干细胞的换液、传代、冻存和复苏：所有细胞均置于37摄氏度、CO2浓度5%的细胞培养箱内进行培养，于超净台内进行操作。（1）尿源干细胞的换液：（a）根据细胞的生长情况，适时进行换液（通常为隔天换液）；（b）培养基和PBS在37摄氏度水浴中预温（c）从细胞培养箱内取出尿源干细胞，去除培养基，加入少量PBS洗涤；（d）去除PBS后加入适量培养基；细胞置于培养箱内继续培养。（2）尿源干细胞的传代：当尿源干细胞生长覆盖培养皿的80%左右时进行传代。（a）培养基、胰酶和PBS在37摄氏度水浴中预温；（b）从细胞培养箱内取出尿源干细胞，去除培养基；（c）加入少量PBS洗涤；（d）去除PBS后加入适量胰酶（完全浸没细胞），于室温或培养箱内进行消化；（e）在倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞松动脱落后（约5分钟），加入2倍培养基终止消化；（f）将细胞悬液转移至50ml离心管，以1500rpm的速度离心5分钟；（g）去除上清，加入适量培养基重悬细胞；（h）将细胞悬液分装入3-4个培养皿中；（i）补足培养基，置于细胞培养箱内培养。（3）尿源干细胞的冻存：（a）培养基、胰酶和PBS在37摄氏度水浴中预温；（b）从细胞培养箱内取出尿源干细胞，去除培养基；（c）加入少量PBS洗涤；（d）去除PBS后加入适量胰酶（完全浸没细胞），于室温或培养箱内进行消化；（e）在倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞松动脱落后（约5分钟），加入2倍培养基终止消化；‐15‐ 第二军医大学博士学位论文（f）将细胞悬液转移至50ml离心管，取出20ul进行细胞计数（g）以1500rpm的速度离心5分钟；（h）配置冻存液：90%的培养基+10%的DMSO；6（i）去除离心后的上清，加入冻存液重悬细胞，使细胞浓度为10个/ml；（j）向每个冻存管内加入1ml细胞悬液；（k）冻存管放入加了异丙醇的细胞冻存盒，置入-80度冰箱；（l）24小时候，取出冻存管，转入液氮中长期保存。（4）尿源干细胞的复苏：（a）培养基在37摄氏度水浴中预温；（b）从液氮中取出细胞冻存管，置入37摄氏度水浴箱迅速溶解、复温；（c）将细胞转移至15ml离心管，在1500rpm的速度下离心5分钟；（d）去除上清，加入适量培养基重悬细胞；（e）将细胞悬液转入培养皿，补足培养基，置于细胞培养箱内培养。4、尿源干细胞增殖分析：5将不同代次的10个尿源干细胞种在10cm的培养皿上（3个复孔，代次为第二代到第五代）；隔天换液，直至细胞覆盖培养皿的70%~80%；胰酶消化细胞，细胞计数，细胞倍增时间可由以下公式计算得出：细胞倍增次数=Log2（终末细胞数量/初始细胞数量）细胞倍增时间=培养时间/细胞倍增次数5、尿源干细胞的多向分化能力：（1）成脂诱导：（a）向基础培养基内加入成脂诱导补充物；442（b）24孔板的每个孔加入3.7*10个尿源干细胞（密度2.1*10个/cm）；（c）在培养箱内培养过夜；（d）细胞铺满培养皿底的100%后，去除原培养基，每孔加入0.5ml诱导培养基，对照组仍然加入尿源干细胞培养基；（e）脂肪细胞较为脆弱，更换培养基时应轻柔（f）每隔2天更换诱导培养基，7-10天后，脂粒开始在细胞内形成；（g）诱导14-21天后，固定细胞，进行脂肪细胞RedOilO染色（2）脂肪细胞的OilRedO染色：（a）取出24孔板，去除培养基，加入PBS洗涤2次；‐16‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用（b）加入4%多聚甲醛，室温固定30分钟；（c）去除多聚甲醛，加入PBS洗涤3次，每次5分钟；（d）吸掉PBS，加入去离子水，润洗2次；（e）加入OilRedO染色剂，染色剂应覆盖细胞；（f）室温孵育50分钟，每10分钟轻微晃动孔板；（g）吸掉OilRedO染色剂，用85%丙二醇洗涤2次；（h）吸出丙二醇，加入去离子水润洗3次；（i）吸出去离子水，加入Gill’s苏木精，室温孵育30秒；（j）吸出苏木精，用去离子水润洗3次细胞；（k）吸出去离子水，用Scott’s自来水孵育，使细胞核泛蓝；（l）去离子水润洗3次，封片，显微镜下观察。（3）成骨诱导：（a）向基础培养基内加入成骨诱导补充物；332（b）24孔板的每个孔加入7.4*10个尿源干细胞（密度4.2*10个/cm）；（c）在培养箱内培养1~2天；（d）细胞铺满培养皿底的50%~70%后，去除原培养基，每孔加入0.5ml诱导培养基，对照组仍然加入尿源干细胞培养基；（e）骨细胞易脱壁，更换培养基时应轻柔（f）每隔2天更换诱导培养基（g）诱导21-28天，固定细胞，进行染色（4）骨细胞的AlizarinRedS染色（a）取出24孔板，去除培养基，加入PBS洗涤2次；（b）加入4%多聚甲醛，室温固定30分钟；（c）去除多聚甲醛，加入PBS洗涤3次，每次5分钟；（d）吸掉PBS，加入去离子水，润洗2次；（e）加入AlizarinRedS染色剂，染色剂应覆盖细胞；（f）室温孵育30秒到5分钟，期间显微镜下观察变化；（g）去离子水洗涤3次，显微镜下观察染色情况。6、尿源干细胞的流式细胞仪分析：（a）培养尿源干细胞；（b）胰酶消化细胞，加入2倍培养基终止消化，将细胞转移至50ml离心管；（c）将细胞悬液吹打均匀，取20ul进行细胞计数；‐17‐ 第二军医大学博士学位论文（d）以1500rpm的速度离心5分钟，去除上清，加入PBS洗涤；（e）以1500rpm的速度离心5分钟，去除上清5（f）用适量的1%BSA将细胞重悬至3*10个/100ul；（g）向每个流式管内加入100ul细胞悬液；（h）向每个流式管内加入待测抗体以及相应的同型对照；（i）在黑暗环境中，4摄氏度孵育45分钟；（j）以1500rpm的速度离心5分钟，去除上清，加入1%BSA洗涤；（k）以1500rpm的速度离心5分钟，去除上清；（l）加入300ul1%BSA重悬；（m）上机分析。各流式管内细胞的抗体处理分别为：未处理，Ms-IgG-FITC，Ms-IgG-APC，Ms-IgG-PE，Ms-CD24-FITC，Ms-CD29-PE，Ms-CD31-FITC，Ms-CD34-APC，Ms-CD44-PE，Ms-CD45-APC，Ms-CD73-PE，Ms-CD90-APC，Ms-CD105-PE，Ms-CD146-PE，Ms-SSEA4-PE，Ms-STRO-1-FTIC7、尿源干细胞肾脏相关表面标记物分析：4（a）将尿源干细胞种在8孔玻璃玻片上，密度10/孔；（b）细胞放置于细胞培养箱内培养；（c）细胞生长至70%~80%后，去除培养基；（d）PBS洗涤3次，每次3分钟；（e）加入200ul4%多聚甲醛，室温固定20分钟；（f）移除多聚甲醛，PBS洗涤三次；（g）加入200ul0.1%Triton-X100，室温孵育3分钟打孔；（h）去除Triton-X100，加入PBS洗涤3次，每次3分钟；（i）加入200ul蛋白封闭液，孵育15分钟；（j）一抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（k）加入一抗，4摄氏度孵育过夜；（l）去除一抗，加入PBS洗涤3次，每次3分钟；（m）将荧光二抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（n）加入二抗，室温孵育30分钟；（o）去除二抗，加入PBS洗涤3次，每次3分钟；（p）在玻片上滴加含有Dapi的封片液，封片；（q）显微镜下观察。‐18‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用各孔内使用的一抗分别是：Rabbitmonoclonalanti-WT1antibody，1：100Rabbitpolyclonalanti-nephrinantibody，1：200Rabbitpolyclonalanti-podocinantibody，1：500使用的二抗为：GoatantirabbitIgGantibody，1：200二、结果：1、尿源干细胞的分离：尿液来源于28岁健康男性。将尿沉渣洗涤并种植在24孔板上5-7天后，可看到部分孔内出现单细胞克隆，多细胞克隆由于无法将克隆完全区分开，可能影响后续鉴定和实验结果，需舍去（图1）。细胞呈纺锤形，增殖迅速。图1：尿源干细胞的分离。A：发现4个尿源干细胞单克隆（箭头和圆圈所指处）；B：显微镜下的单克隆（100X）。2、尿源干细胞增殖分析：尿源干细胞倍增时间如下：尿源干细胞代次倍增时间（小时）第二代21.7±1.1第三代21.6±1.8第四代23.9±2.5第五代29.3±2.5通过持续的培养，所有尿源干细胞均可培养至10代以上。‐19‐ 第二军医大学博士学位论文3、尿源干细胞的多向分化能力：OilRedO染色可将脂肪染成红色。在成脂诱导培养基的诱导下，14天后，尿源干细胞成功的被诱导成为脂肪细胞。OilRedO染色下可见红色的脂肪颗粒（图2A）。对照细胞始终在尿源干细胞培养基条件下生长，未分化成脂肪细胞，染色呈阴性。AlizarinRedS染色可将钙盐染成红色。在成骨诱导培养基的诱导下，21天后，尿源干细胞成功的被诱导成为骨细胞。AlizarinRedS染色下可见红色的钙盐沉积（图2B）。对照细胞始终在尿源干细胞培养基条件下生长，未分化成骨细胞，染色呈阴性。图2：尿源干细胞多向分化能力分析。A：OilRedO染色，可见诱导后的细胞内存在红色脂肪颗粒（100X）；B：AlizarinRedS染色，诱导后的细胞附近可见红色钙盐沉积（100X）。4、尿源干细胞的流式细胞仪分析：尿源干细胞表面标记物的流式分析结果如下：尿源干细胞表达CD24、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146等间充质干细胞的表面标志物，不表达CD31、CD34、CD45等造血细胞表面抗原（图3）。表面标记物阳性率表面标记物阳性率CD2499%CD14696%CD2999%SSEA497%CD4499%CD31<1%CD7399%CD34<1%CD9093%CD45<1%CD10547%STRO-12%‐20‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图3：尿源干细胞表面标记物的流式分析结果。5、尿源干细胞肾脏相关表面标记物分析：尿源干细胞表达WT1，Nephrin，Podocin等肾脏相关的抗原（图4-6）。图4：免疫细胞化学，anti-WT1抗体染色。A：阳性染色（200X）；B：细胞核Dapi着色（200X）；C：合成图片（200X）。‐21‐ 第二军医大学博士学位论文图5：免疫细胞化学，anti-nephrin抗体染色。A：阳性染色（200X）；B：细胞核Dapi着色（200X）；C：合成图片（200X）。图6：免疫细胞化学，anti-podocin抗体染色。A：阳性染色（200X）；B：细胞核Dapi着色（200X）；C：合成图片（200X）。三、讨论：尿液中绝大多数细胞是已经分化完全，最常见的细胞成分是尿路上皮细胞，这些细胞体积较大，呈扁平状，尿路上皮细胞通常无法贴壁生长，虽然研究发现极少数的尿路33,34上皮细胞可在体外增殖，其培养基也多为特别配置，尿路上皮细胞较难适应含有血清的培养基。此外，尿液中还有一些炎性细胞和管型等等。这些成分在培养皿中无法贴壁生长，换液时被清除。在所有尿液的细胞成分中，只有尿源干细胞能够贴壁，并不断的扩增。通常尿沉渣被种在24孔板后48-72小时即可观察到贴壁的细胞，再经过3-525天即可观察到单细胞克隆。据文献报道，每100ml尿液中约含7-8个克隆，因此24孔板的一个孔中可能包含2个或者更多的克隆。为了证明所获得的克隆是干细胞，必须对细胞进行鉴定。干细胞有2个最重要的特征：通过有丝分裂自我更新的能力；分化成35为一些列不同种类细胞的能力。多克隆细胞在鉴定时带来混杂因素，必须舍去，取得单细胞克隆鉴定后，方可用于之后的实验。尿源干细胞初期生长速度较快，在细胞到达第五代之前，平均倍增时间约为21-24小时；到达第五代之后，生长速度有所减慢，达‐22‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用到29小时左右，因此，本实验中所采用的细胞均取自第五代之前，以保证细胞的活性和更加稳定、可靠的实验结果。细胞培养至第八代之后，生长速度继续减缓，多数克隆可被培养至十代以上，说明尿源干细胞具备自我更新的能力，这种保持在未分化状态的26,36,37自我更新能力可能与尿源干细胞大多端粒酶阳性有关。为了证明尿源干细胞的多向分化能力，我们将其诱导成为脂肪细胞和骨细胞。其他研究组还将其诱导成为软骨细26胞、尿路上皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞以及神经细胞。多向分化的能力，是尿源干细胞可能被用于多种组织或器官的重建。去细胞支架上种植平滑肌细胞38以及尿路上皮细胞后，可成为人工膀胱，扩大膀胱容量。该技术也被应用到了临床，7名患有膀胱疾病的患者被纳入研究，自体获取的尿路上皮细胞和平滑肌细胞经过体外扩增后被种植在胶原蛋白-聚乙醇酸支架上，人工膀胱移植回体内后的结果表明，患者39的膀胱容量以及顺应性均得到了提高。然而，自体细胞的获取需要通过穿刺，为了获得较大量的细胞，甚至需要进行活检，从而提高了出血、感染的风险，也增加了患者的痛苦。且对于膀胱癌患者或终末期膀胱疾病患者，这样的手段可能难以实现。尿源干细胞可在较高的效率下分化成为尿路上皮细胞和平滑肌细胞，并可通过多次收集尿液的方法获得足够多的干细胞，因此可能成为更好的细胞来源。即使在膀胱癌患者的上尿路获40取的尿源干细胞，由于其在体内不形成畸胎瘤或肿瘤，也可能成为可用的细胞来源。尿源干细胞向骨骼肌的分化也是与临床应用较为接近的领域。扩约肌在控制排尿的过程中起着至关重要的作用，细胞疗法可能对增强括约肌功能有所帮助，从而治疗尿失禁。已有的研究结果提示，向括约肌内注射肌肉祖细胞，可在1个月之后将括约肌功能提高29月41%。注射分化成为骨骼肌细胞的尿源干细胞可能减少患者创伤。通过对尿源干细胞表面标志物的流式监测，我们发现尿源干细胞表达CD24，CD29，CD44，CD73，CD105等，不表达CD31，CD34，CD45。这些均符合国际细胞疗法协会对间充质干细胞的定41义。尿液由肾脏产生，经过输尿管、膀胱、尿道最终排出体外，在这个过程中，尿源干细胞可能从任何一个部分脱落。明确尿源干细胞的来源可以帮助理解其特性和潜能。尿40源干细胞可以从上尿路获得，说明肾脏是可能的来源。另有研究认为尿源干细胞最可能的来源是肾脏。女性肾移植患者接受男性来源的供体，收集这些女性患者的尿液并分26离尿源干细胞，结果发现部分尿源干细胞含有Y染色体，来源于供体的肾脏。与此同时，尿源干细胞表达CD146，PAX2等肾脏的抗原，从侧面反映了其相关性。肾脏目前缺乏特异性的抗原，我们对尿源干细胞进行免疫细胞学染色，发现尿源干细胞表达WT-1，nephrin和podocin，这些均说明尿源干细胞可能来源于肾脏。尿源干细胞在再生医学以及治疗慢性肾病的研究中也存在一定的问题。首先，尿液42具有较高的细胞毒性。Adamowicz等研究了尿液对骨髓来源的间充质干细胞的影响。‐23‐ 第二军医大学博士学位论文发现当间充质干细胞在含有尿液的培养环境中，生长速度较对照组明显减慢。细胞暴露于尿液后的1小时内，出现大量的细胞死亡。尿源干细胞从尿液中提取，受尿液细胞毒性的影响，能否顺利的在再生医学中使用尚有待探讨。其次，尿源干细胞最可能的来源是肾脏，慢性肾病患者的肾脏功能受损、结构一定程度上被破坏，能否产生足够数量的健康的尿源干细胞目前仍是未知数。总之，再生医学以及肾脏再生中尿源干细胞的应用是一个新兴的领域，尿源干细胞可能成为新的细胞来源，给慢性肾病患者以及其他终末期疾病患者带来新的治疗选择和希望。‐24‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用第二部分：尿源干细胞的组织相容性研究在第一部分中，我们成功的进行了尿源干细胞的分离和鉴定，认为其属于间充质干20,23细胞。骨髓来源以及脂肪来源的间充质干细胞均对恢复肾功能有益，而尿源干细胞43对肾功能的改善作用目前尚无报道。异体植入的细胞可能被清除，肾脏是血流丰富、13结构复杂、代谢旺盛的器官，Rota等向裸鼠体内注射羊水干细胞，随访31天后，发现绝大多数的细胞已经被清除。因此，尿源干细胞是否能在正常肾脏中存活是首要的需要回答的问题。其次，在肾脏微环境下，尿源干细胞是否能与肾脏结构融合，是否够分化成为肾脏细胞也是值得关注的问题。本部分中，我们利用绿色荧光蛋白（GFP）将尿源干细胞注射入裸小鼠的肾脏实质内，观察其在肾脏组织内的生理变化。一、材料和方法：（一）材料：1、主要实验设备：离心机：Eppendorf公司超净台：Baker公司细胞培养箱：Hera公司倒置显微镜：CarlZeiss公司细胞计数板：HausserScientific公司正置显微镜：Leica公司37摄氏度恒温水浴箱：Isotemp公司-80摄氏度冰箱：Sanyo公司生物安全柜：Kewaunee公司微量加样器：Eppendorf公司移液器：Propette公司细菌培养箱：NewBrunswick公司高速离心机：Sorvall公司微量紫外分光光度计：ThermoScientific公司流式细胞分选仪：BD公司石蜡切片机：Leica公司麻醉机：Vetequip公司‐25‐ 第二军医大学博士学位论文动物实验器材：实验室提供高温高压灭菌设备：Steris公司组织处理器：Leica公司60摄氏度恒温烘箱：Fisher公司2、主要实验耗材：高糖DMEM培养基：Gibco公司角质形成细胞无血清培养基：Invitrogen公司Ham’sF12培养基：Gibco公司胎牛血清：Gibco公司左旋-谷氨酰胺：Fisher公司青霉素/链霉素：Gibco公司表皮生长因子：Gibco公司霍乱毒素：Sigma-Aldrich公司氢化可的松：Sigma-Aldrich公司胰岛素：Gibco公司腺嘌呤：Sigma-Aldrich公司转铁蛋白：Sigma-Aldrich公司1L培养基过滤器：ThermoScientific公司15ml、50ml离心管：Falcon公司磷酸盐缓冲液（PBS）：Sigma-Aldrich公司5ml、10ml、25ml、50ml移液管：Falcon公司微量加样枪头：Fisher公司胰酶：Gibco公司10cm培养皿、15cm培养皿：BD二甲基桠枫（DMSO）：Sigma-Aldrich公司细胞冻存管：GreinBio-One公司细胞冻存盒：实验室提供异丙醇：Fisher公司含pWPTXL、psPAX2、pMD2.G组件的细菌：实验室冻存酵母提取物：Sigma-Aldrich公司蛋白胨：Sigma-Aldrich公司氯化钠：Sigma-Aldrich公司‐26‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用琼脂糖：Sigma-Aldrich公司氨苄青霉素：Sigma-Aldrich公司质粒抽提试剂盒：Qiagen公司转染试剂FuGeneHD：Promega公司促转导剂polybrene：Sigma-Aldrich公司293T细胞系：实验室冻存台盼蓝：Gibco公司无痛点消毒剂：Aplicare公司19号、30号针头：BD公司1ml、3ml、5ml针筒：BD公司异氟醚：Forane15号刀片：Bard-Parker公司5-0可吸收缝线：Ethicon公司6-0prolene缝线：Ethicon公司生理盐水：Baxter公司无菌纱布：Curity公司无菌手套：Microtouch公司10%福尔马林：Leica公司二甲苯：Fisher公司乙醇：Warner-Graham公司柠檬酸缓冲液：PolyScientific公司Gill’s苏木精：Sigma-Aldrich公司载玻片：GlobeScientific公司盖玻片：Surgipath公司内源性过氧化物酶封闭液：Vector公司抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒：Vector公司蛋白封闭液：Dako公司抗体稀释液：Dako公司抗生物素蛋白生物素复合物：Vector公司NovaRed显色试剂盒：Vector公司封片剂：Surgipath公司苏丹黑溶液：实验室配置含Dapi的封片剂：Vector公司‐27‐ 第二军医大学博士学位论文3、主要实验抗体：Rabbitmonoclonalanti-HLAantibody：Abcam公司，ab52922Mousemonoclonalanti-GFPantibody：SantaCruz公司，sc9996Rabbitmonoclonalanti-CD73：Abcam公司，ab133582Rabbitmonoclonalanti-CD90：Abcam公司，ab133350GoatantirabbitIgGantibody：Vector公司，BA-1000GoatantimouseIgGantibody：Vector公司，FI-1000GoatantirabbitIgGantibody：Invitrogen公司，A110724、实验动物：Nu/Nu裸小鼠：CharlesRiver公司（二）方法：1、尿源干细胞的GFP标记：细菌培养基的配置：在1L去离子水中加入5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化钠，高温高压灭菌后加入氨苄青霉素使之终浓度成为1mg/mL。细菌琼脂糖培养基的制备：在1L去离子水中加入5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化钠，高温高压灭菌。当培养基溶液温度降至60摄氏度左右时加入氨苄青霉素使之终浓度成为1mg/mL，将溶液浇入10cm无菌培养皿，待培养基凝固后，密封，置入4摄氏度冰箱保存，供之后实验使用。（1）GFP慢病毒组件的制备：（a）含有pWPTXL、psPAX2、pMD2.G组件的细菌分别置于冰上融化；（b）无菌枪头沾取少量液体，于琼脂糖培养基上划线，划S型曲线并注意交叉，有助于单克隆的形成；（c）37摄氏度细菌培养箱培养过夜；（d）选取生长健康的单克隆，加入2ml细菌培养基中，37摄氏度，300rpm震荡约8小时；（e）将启动培养基加入250ml细菌培养基，37摄氏度摇床培300rpm培养过夜，次日可见培养基浑浊，细菌生长；（f）在4摄氏度6000g条件下离心15分钟，收获细菌细胞；（g）弃上清，用10mlP1缓冲液重悬沉淀；（h）加入10mlP2缓冲液，充分混合均匀，室温静置5分钟；‐28‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用（i）向裂解液中加入10mlP3缓冲液，充分混合均匀；（j）将裂解液倒入试剂盒提供的容器，室温孵育10分钟；（k）移除盖子，轻柔的插入柱塞，将细胞裂解液过滤到50ml离心管中；（l）向细胞裂解液中加入2.5mlER缓冲液，混匀，冰上孵育30分钟；（m）向柱子中加入10mlQBT缓冲液，使之自然漏出，平衡柱子；（n）将细胞裂解液加入平衡后的柱子，使之自然漏出；（o）用30mlQC缓冲液洗涤柱子，共洗2次；（p）用15mlQN缓冲液洗脱DNA；（q）加入室温的异丙醇沉降DNA，混合均匀；（r）在4摄氏度15000g下离心30分钟，小心地去除上清；（s）用5ml70%的酒精洗涤DNA，15000g离心10分钟，小心地去除上清；（t）沉淀物干燥5-10分钟，用TE缓冲液溶解DNA。（u）测定DNA浓度（2）GFP慢病毒的制备：（a）培养293T细胞（DMEM+10%FBS）；5（b）转染前一天，将293T细胞以8*10个/孔的密度种到6孔板上；（c）转染前1小时换液；（d）每200ulDMEM培养基中加入1.5ugpWPTXLDNA，1ugpsPAX2DNA，0.5ugpMD2GDNA；（e）每200ulDNA混合液中加入10ulFugeneHD转染试剂，室温孵育15分钟；（f）6空板每孔中逐滴加入200ul混合液，请问震荡混匀；（g）细胞培养箱内孵育过夜；（h）将293T培养基更换为无抗生素的尿源干细胞培养基；（i）显微镜下观察细胞形态和荧光，48小时候收集含有病毒的培养基；（j）在4摄氏度1500rpm下离心5分钟，收集上清，去除细胞成分；（k）病毒液分装、冻存于-80摄氏度，供之后实验使用。（3）尿源干细胞的病毒转导：（a）培养尿源干细胞，覆盖培养皿的80%左右；（b）室温融化含有GFP的慢病毒；（c）向8ml培养基中加入2ml病毒液以及10ulPolybrene促转导剂，混合均匀；（d）去除细胞培养基，加入病毒混合液，细胞培养箱内孵育过夜；（e）去除病毒混合液，更换为正常培养基；（f）1-2天后，显微镜下观察转导结果。‐29‐ 第二军医大学博士学位论文2、GFP阳性尿源干细胞的流式细胞分选：（a）未转导的细胞作为阴性对照；（b）扩增病毒转染后的尿源干细胞；7（c）消化细胞，将细胞悬浮至10个/ml培养基；（d）收集管中加入0.5ml培养基；（e）上机分选。3、尿源干细胞的体内注射：该动物实验经动物保护和使用委员会批准。小鼠置于12小时白天/12小时黑夜的恒温环境，并配有充足的水和食物。7将GFP标记的尿源干细胞悬浮至2*10个/mL，并吹打成单细胞悬液。细胞通过注射器和30号针头后，取10ul细胞悬液与打出来的细胞与台盼蓝1：1混合后置于细胞计数板，观察细胞形态、活细胞百分比。将剩余细胞转入1ml注射器，置于冰上备用。手术在无菌的环境下进行，术者穿戴手术衣、口罩、帽子、鞋套以及无菌手套。12只年龄为9周的裸小鼠用异氟醚进行吸入麻醉。小鼠置于无菌铺巾上，在其下方放置加热板，以保持小鼠体温。小鼠腹部用无痛碘消毒后，用15号刀片做腹部正中切口，并切开腹部肌肉和筋膜。用拉钩暴露小鼠腹腔，拨开肠道组织，将肠道组织置于生理盐水浸湿的纱布上，暴露一侧肾脏。取1ml注射器，震荡混匀细胞，安装30号针头，排空注射器内的空气，将针头插入小鼠肾脏皮质内，缓慢注射25ul细胞悬液，注射完毕后，针头在肾脏组织内留置约1分钟以减少出血和细胞悬液漏出，拔出针头。肾上极和下极各注射一次。随后暴露对侧肾脏，以同样的方式注射PBS作为阴性对照。若肾脏出血，则压迫止血，压迫止血无效时行单侧肾切除术。观察1分钟，确认肾脏及腹腔内无出血后，用5-0可吸收缝线关闭腹腔和肌肉，6-0prolene缝线关闭皮肤。结束吸入麻醉，清洁小鼠，放回鼠笼使之恢复。7天后拆除皮肤缝线。在术后1周、2周、3周、4周各处死3只小鼠，获取双侧肾脏进行研究。处死时，小鼠被置于密闭容器中，逐渐增加CO2浓度，直至小鼠完全停止呼吸，观察1分钟确认小鼠死亡后，将小鼠取出，进行颈椎离断后，获取双侧肾脏。4、肾脏标本的处理和切片：取得肾脏后，置入10%福尔马林溶液固定24-48小时，随后将组织放入组织处理器进行脱水，石蜡包埋。用石蜡切片机将组织切成厚度为5um切片，60摄氏度烘烤2小时以蒸发水分，切片常温干燥环境下储存，供后续试验使用。‐30‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用5、肾脏切片的免疫组织化学染色：（a）切片置于60摄氏度烤箱中烘烤30分钟，取出静置到恢复室温；（b）放置于100%的二甲苯中脱蜡15分钟，随后在100%至75%的酒精中各浸泡5分钟梯度水化，最后将切片置于去离子水中；（c）切片置于250ml柠檬酸缓冲液中，加热溶液到98摄氏度并保持15分钟，取出切片，室温静置20分钟；（d）在切片上滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（e）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的A试剂，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（f）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的B试剂，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（g）滴加蛋白封闭液，室温孵育20分钟；（h）一抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（i）倒掉蛋白封闭液，滴加一抗，4摄氏度孵育过夜；（j）PBS洗涤3次，每次10分钟；（k）生物素标记的二抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（l）滴加二抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，每次10分钟；（m）滴加抗生物素蛋白生物素复合物，室温孵育30分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（n）NovaRed显色，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片后显微镜下观察。所用一抗为：Rabbitmonoclonalant-HLAantibody，1：300二抗为：GoatantirabbitIgGantibody，1：2006、肾脏切片的免疫荧光双染色：（a）切片置于60摄氏度烤箱中烘烤30分钟，取出静置到恢复室温；（b）放置于100%的二甲苯中脱蜡15分钟，随后在100%至75%的酒精中各浸泡5分钟梯度水化，最后将切片置于去离子水中；（c）切片置于250ml柠檬酸缓冲液中，加热溶液到98摄氏度并保持15分钟，取出切片，室温静置20分钟；（d）在切片上滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（e）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的A试剂，室温孵育15分钟后，PBS‐31‐ 第二军医大学博士学位论文洗涤3次，每次5分钟；（f）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的B试剂，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（g）滴加蛋白封闭液，室温孵育20分钟；（h）一抗（第一种）在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（i）倒掉蛋白封闭液，滴加一抗（第一种），4摄氏度孵育过夜；（j）PBS洗涤3次，每次10分钟；（k）荧光标记的二抗（第一种）在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（l）滴加二抗（第一种），室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，每次10分钟；（m）滴加蛋白封闭液，室温孵育20分钟；（n）一抗（第二种）在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（o）倒掉蛋白封闭液，滴加一抗（第二种），4摄氏度孵育过夜；（p）PBS洗涤3次，每次10分钟；（q）荧光标记的二抗（第二种）在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（r）滴加二抗（第二种），室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，每次10分钟；（s）滴加苏丹黑溶液，室温孵育5分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟；（t）在玻片上滴加含有Dapi的封片液，封片后显微镜下观察。所用抗体浓度及组合如下所示：Rabbitmonoclonalanti-HLAantibody，1：300Mousemonoclonalanti-GFPantibody，1：50Rabbitmonoclonalanti-CD73，1：200Rabbitmonoclonalanti-CD90，1：200GoatantimouseIgGantibody，1：200GoatantirabbitIgGantibody，1：200一抗（第一种）二抗（第一种）一抗（第二种）二抗（第二种）组合1RabbitantiHLAGoatantiRabbitMouseantiGFPGoatantiMouse组合2RabbitantiCD73GoatantiRabbitMouseantiGFPGoatantiMouse组合3RabbitantiCD90GoatantiRabbitMouseantiGFPGoatantiMouse二、结果：1、尿源干细胞的GFP标记：‐32‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用DNA抽提后，GFP-慢病毒组件的DNA浓度分别为：DNA浓度pWPTXL2560.5ng/ulpsPAX22001.2ng/ulpMD2G3721.8ng/ul慢病毒将GFP转导入尿源干细胞2天后，约60%~70%的尿源干细胞GFP阳性，在显微镜下可观察到绿色荧光（图7）。图7：慢病毒转导GFP后的尿源干细胞。A：白光通道下观察到的尿源干细胞（100X）；B：绿色荧光通道下观察到的尿源干细胞（100X）。2、尿源干细胞的流式细胞分选：未被GFP-慢病毒转导的尿源干细胞作为阴性对照，其流式结果见图8。为了提高分选后的GFP阳性率，并使细胞表达的GFP亮度类似，我们选取了荧光强度较高，且较为一致的细胞群，其定义如图9所示。分选后的GFP阳性细胞增殖情况较好，数量可以满足注射需求。分选后的细胞GFP阳性率较未分选前明显提高，达到95%以上（图10）。‐33‐ 第二军医大学博士学位论文图8：未转导的尿源干细胞的流式分析结果。‐34‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图9：GFP阳性尿源干细胞的选取。‐35‐ 第二军医大学博士学位论文图10：分选后的尿源干细胞。A：表达GFP细胞发出绿色荧光（100X）；B：Dapi着色的细胞核（100X）；C：合成图像（100X）。3、尿源干细胞的体内注射：7尿源干细胞可被悬浮至2*10个/ml，吹打均匀后，显微镜下提示多数细胞呈单个悬浮的状态，台盼蓝染色提示，活细胞数量达到90%以上（图11）。细胞注射过程顺利，术中未见明显细胞悬液渗漏，所有小鼠均耐受手术，术后恢复良好，术中细胞注射方式见图12。‐36‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图11：台盼蓝染色（100X）图12：尿源干细胞的注射。4、尿源干细胞示踪：细胞注射一周后，可见肾脏内有未吸收的陈旧出血区域，即注射区，HLA染色阳性的细胞集中在注射区附近（图13A）。注射两周后，尿源干细胞数量明显减少，分布相对分散，部分细胞迁移至肾小管间的间质结构内（图13B）。注射三周后，阳性细胞数量很少，在组织切片中难以找到。对术后两周的标本进行HLA和GFP的双染色，部分细胞两种抗体均阳性（图14、15）。图13：肾脏组织HLA染色。A：细胞注射后一周（400X）；B：细胞注射后两周（400X）。‐37‐ 第二军医大学博士学位论文图14：细胞注射一周后，肾脏组织HLA、GFP双染色。A：HLA染色（630X）；B：GFP染色（630X）；C：Dapi（630X）；D：合成图像（630X）。图15：细胞注射两周后，肾脏组织HLA、GFP双染色。A：GFP染色（630X）；B：HLA染色（630X）；C：Dapi（630X）；D：合成图像（630X）。‐38‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用5、尿源干细胞在体内表面标志物的表达：用抗GFP抗体和抗干细胞表面标志物的抗体对注射细胞两周后的肾脏切片进行双染色，发现尿源干细胞仍然表达间充质干细胞的表面抗体：CD73、CD90（图16、17）。图16：细胞注射两周后，肾脏组织GFP、CD73双染色。A：GFP染色（630X）；B：CD73染色（630X）；C：Dapi（630X）；D：合成图像（630X）。图17：细胞注射两周后，肾脏组织GFP、CD90双染色。A：GFP染色（630X）；B：CD90染色（630X）；C：Dapi（630X）；D：合成图像（630X）。‐39‐ 第二军医大学博士学位论文三、讨论：细胞注射至体内后，如何对其追踪至关重要。在干细胞研究方面，最常见的标记方44法是膜染料标记（例如PKH-26、PKH-67等），此类染料原理类似，其荧光染料具有较长的脂类尾巴，从而与细胞膜的脂质部分结合。然而，由于结合于细胞膜的荧光染料数量有限，随着细胞的分裂和增殖，细胞膜面积的总和增大，荧光染料密度必然减小，45从而导致信号强度减低。此外，由于肾脏自发荧光较强，衰减后的信号更加难以捕捉，给细胞的追踪带来难度。GFP标记后的细胞表达GFP蛋白，荧光信号强度稳定，利于观察，但GFP标记间充质干细胞效率相对较低，且可能影响细胞生长。我们在标记后采用流式细胞技术对细胞进行分选，解决了效率的问题，细胞生长情况良好，达到了实46验的要求。在进行免疫荧光染色时，采用苏丹黑处理切片，大大降低了自发荧光的起那个度，从而便于观察。HLA为人特异性抗原，当免疫组织化学染色阳性时，说明该细胞的细胞来源是人，即我们注射的尿源干细胞。细胞注射1周后，肾脏组织内可见局限的出血区域，考虑是注射细胞时造成的陈旧出血，即注射区，绝大多数HLA阳性的细胞仍位于注射区附近。细胞注射2周后，可发现肾脏组织内的出血已基本吸收，注射区有纤维化组织产生，大部分HLA阳性细胞聚集于该区域，而有少量细胞向注射区以外迁移，逐渐渗透入肾脏组织，位于肾小管之间的间质成分呢。进而，免疫荧光双染色照片中可发现HLA阳性的细胞同时表达GFP，进一步确认了这些细胞是被注射入小鼠肾脏的尿源干细胞。以上结果均表明尿源干细胞可在小鼠体内存活，具备迁移的能力，但未观察到尿源干细胞与肾脏组织或细胞的融合。47干细胞虽然可能有利于肾功能恢复，但具体机制仍不明确。可能的机制有以下几种：干细胞在肾脏环境内分化成为肾脏细胞；干细胞与肾脏细胞或结构的融合；干细胞分泌的生长因子、细胞因子等生物活性物质有利于肾脏功能的修复；干细胞的免疫调节48作用。Ninichuk等将间充质干细胞注射到间质纤维化的慢性肾病小鼠模型中，发现较49多细胞聚集在肾小管旁的毛细血管中，未发现细胞分化成为肾脏细胞。少量研究提示，50在肾脏损伤模型中，细胞可能自发的与肾小管细胞进行融合，从而帮助恢复肾功能。而更多的研究认为，干细胞对肾功能的改善作用主要来源于其旁分泌和内分泌功能，这种不依赖细胞分化的机制首先在心肌修复中被报道，通过动脉注射的干细胞可在注射后51立即保护心肌，减轻急性缺血的损伤。Bi等采用间充质干细胞预处理过的培养基进行了体外实验，发现这些培养基可诱导肾脏来源的上皮细胞，使之迁移、增殖。用细胞毒52性药物顺铂处理这些上皮细胞时发现，预处理的培养基缓解了肾小管细胞的凋亡，该过程中，可能有多种生长因子等生物活性物质参与，血管内皮生长因子（VEGF）可能是其中的一员。VEGF不仅是内皮细胞存活和生长的重要因子，同时也在支架重构、炎‐40‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用53性细胞趋化作用中起到了重要作用。在肾脏方面，VEGF可保护肾小管上皮细胞，并53-55促进肾小管再生。Togel等应用siRNA将骨髓间充质干细胞的VEGF基因敲除后，56将细胞注射入急性肾损伤的小鼠模型中，并在对照组中注射正常的干细胞。结果显示，敲除VEGF基因后，骨髓间充质干细胞对肾脏的保护作用下降，动物模型的死亡率提高。尿源干细胞在肾脏内是否能够分化目前尚无报道，常规的研究方法为进行肾脏特异性的抗原染色，然而由于尿源干细胞最可能的来源是肾脏组织，自身表达多种肾脏抗原（例如第一部分测试的WT1、nephrin、podocin等），因此即使肾脏抗原阳性，也不能证明细胞分化。然而，若尿源干细胞分化，很可能同时丢失干细胞的表面标记物。因此，我们采用了双染色技术，在标记GFP的同时标记干细胞抗原，若尿源干细胞的干细胞表面标志物丢失，则说明存在分化的可能。通过对间充质干细胞最常见的表面抗原CD73和CD90的染色，我们观察到肾脏内的尿源干细胞仍然保留着干细胞抗原，分化可能性较小。通过HLA染色，我们发现尿源干细胞游主要离于注射区和肾脏间质，未发现融合的现象。总之，尿源干细胞可以在肾脏组织内存活，在有限的随访时间内，尿源干细胞分化的可能性小，显微镜下未发现与肾脏组织结构的融合。由于尿源干细胞属于间充质干细胞家族，且在体内的生物学行为类似，可能成为治疗慢性肾病无创的自体细胞来源。尿源干细胞是否对慢性肾病有治疗作用及其机制需要进一步的研究。‐41‐ 第二军医大学博士学位论文第三部分：尿源干细胞治疗慢性肾病的研究57慢性肾病指由于肾脏组织纤维化所造成的进行性的肾功能下降，其诊断标准为肾21小球滤过率持续低于60mL/min/1.73m超过3个月。随着发病率的不断升高，慢性肾58病已经成为世界范围内的是重大的公共卫生问题，也是导致患者死亡的重要疾病之一，其发病率不断上升与全球人口不断增多，心血管疾病以及糖尿病发病率升高有着密不可59分的联系。慢性肾病难以治愈，主要治疗手段仅能够减慢疾病进展的速度。慢性肾病最终将导致器官衰竭，即终末期肾病，相关预测显示，截至2015年，美国终末期肾病60患者的数量将较21世纪初增长约44%，除了给患者带来痛苦以外，也造成了极大的经59济负担和社会负担。对于终末期肾病，目前有效的治疗方法仍然有限。透析是最常用的治疗方法，但透析降低患者生活治疗，且仅替代肾脏的滤过功能而无法替代内分泌等作用；另外的选择为肾移植，而供体短缺和长期免疫抑制剂的服用均限制了该技术的应15用，临床上急需新的治疗手段。研究者们曾经认为肾脏是不增殖、不可再生的器官，61然而近年来成人干细胞的发现打破了这一理论，间充质干细胞在治疗肾病中有着良好的前景。从之前两个部分的研究我们可以得到以下结果：1）尿源干细胞获取方式无创，且为自体细胞，具备间充质干细胞的特性；2）尿源干细胞可在肾脏内存活，在随访时间内保持了未分化的状态。由于尿源干细胞最可能的来源是肾脏组织，可能更加适应肾脏微环境，更好的改善肾功能。基于此猜想，我们构建了慢性肾病裸大鼠模型，通过肾皮质内注射尿源干细胞的方法研究其对肾功能的改善作用。一、材料和方法：（一）材料：1、主要实验设备：离心机：Eppendorf公司超净台：Baker公司细胞培养箱：Hera公司倒置显微镜：CarlZeiss公司细胞计数板：HausserScientific公司正置显微镜：Leica公司37摄氏度恒温水浴箱：Isotemp公司‐42‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用-80摄氏度冰箱：Sanyo公司生物安全柜：Kewaunee公司微量加样器：Eppendorf公司移液器：Propette公司流式细胞分选仪：BD公司石蜡切片机：Leica公司麻醉机：Vetequip公司动物实验器材：实验室提供高温高压灭菌设备：Steris公司组织处理器：Leica公司60摄氏度恒温烘箱：Fisher公司肌酐浓度测定仪：Beckman公司2、主要实验耗材：高糖DMEM培养基：Gibco公司角质形成细胞无血清培养基：Invitrogen公司Ham’sF12培养基：Gibco公司胎牛血清：Gibco公司左旋-谷氨酰胺：Fisher公司青霉素/链霉素：Gibco公司表皮生长因子：Gibco公司霍乱毒素：Sigma-Aldrich公司氢化可的松：Sigma-Aldrich公司胰岛素：Gibco公司腺嘌呤：Sigma-Aldrich公司转铁蛋白：Sigma-Aldrich公司1L培养基过滤器：ThermoScientific公司15ml、50ml离心管：Falcon公司磷酸盐缓冲液（PBS）：Sigma-Aldrich公司5ml、10ml、25ml、50ml移液管：Falcon公司微量加样枪头：Fisher公司胰酶：Gibco公司10cm培养皿、15cm培养皿：BD‐43‐ 第二军医大学博士学位论文二甲基桠枫（DMSO）：Sigma-Aldrich公司细胞冻存管：GreinBio-One公司细胞冻存盒：实验室提供异丙醇：Fisher公司台盼蓝：Gibco公司无痛点消毒剂：Aplicare公司19号、30号针头：BD公司1ml、3ml、5ml针筒：BD公司异氟醚：Forane苯巴比妥注射液：Biorad公司15号刀片：Bard-Parker公司3-0可吸收缝线：Ethicon公司4-0prolene缝线：Ethicon公司酮洛芬注射液：Pfizerg公司庆大霉素注射液：Depai公司生理盐水：Baxter公司无菌纱布：Curity公司无菌手套：Microtouch公司10%福尔马林：Leica公司二甲苯：Fisher公司乙醇：Warner-Graham公司柠檬酸缓冲液：PolyScientific公司Gill’s苏木精：Sigma-Aldrich公司载玻片：GlobeScientific公司盖玻片：Surgipath公司伊红染料：Sigma-Aldrich公司Bouin固定液：Sigma-Aldrich公司Weigert式铁苏木精：Sigma-Aldrich公司丽春红酸性品红液：实验室配置1%磷钼酸水溶液：实验室配置2%苯胺蓝液：实验室配置亮绿液：实验室配置内源性过氧化物酶封闭液：Vector公司‐44‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒：Vector公司蛋白封闭液：Dako公司抗体稀释液：Dako公司抗生物素蛋白生物素复合物：Vector公司NovaRed显色试剂盒：Vector公司封片剂：Surgipath公司3、主要实验抗体：Rabbitmonoclonalanti-HLAantibody：Abcam公司，ab52922Rabbitpolyclonalanti-collagentypeIantibody：Abcam公司，ab34710Rabbitpolyclonalanti-collagentypeIIIantibody：Abcam公司，ab7778MousemonoclonalantiRatCD68：AbDSerotec公司，MCA341RGoatantirabbitIgGantibody：Vector公司，BA-1000GoatantimouseIgGantibody：Vector公司，BA-92004、实验动物：Nu/Nu裸大鼠：CharlesRiver公司（二）方法：本部分所涉及动物实验经动物保护和使用委员会批准。大鼠置于12小时白天/12小时黑夜的恒温环境，并配有充足的水和食物。实验设计流程示意图见图18。1、肾脏的功能学检查：（1）血清肌酐检查：裸大鼠用异氟醚进行吸入麻醉，仰卧置于铺巾上，在尾巴中间腹侧呈30度~45度角插入19号针头，穿刺进入尾静脉，将血液收集入采集管后，拔出针头，压迫止血，结束吸入麻醉，大鼠置入鼠笼使之完全恢复。标本置于冰上保存，离心后取血清，上机读数。‐45‐ 第二军医大学博士学位论文图18：动物实验设计流程图（2）肾小球滤过率（GFR）的计算：将裸大鼠置于底部为铁丝的代谢笼过夜，并提供足够的水和食物，代谢笼下方放置收集管，收集尿液约16小时。第二天早上，将大鼠放回鼠笼，测定尿液体积，尿液上机测定肌酐浓度。结合血清肌酐结果，GFR采用以下公式计算获得：GFR=尿肌酐*尿液体积/血清肌酐浓度/时间2、动物模型的建立：年龄为10周的裸大鼠完善基础血清肌酐、GFR检查。手术在无菌环境下进行，术者穿戴手术衣、口罩、帽子、鞋套以及无菌手套。大鼠通过腹腔注射苯巴比妥进行麻醉（70mg/kg）。大鼠置于无菌铺巾上，呈仰卧位，其下方放置加热板以保持体温。大鼠腹部经无痛点消毒后，用15号刀片做腹部正中切口，剪开肌肉和筋膜，用拉钩暴露大鼠腹腔。将37摄氏度生理盐水浸湿的纱布放置于腹部切口一次，将大鼠肠道组织取出，置于润湿的纱布上，暴露一侧肾脏，用无损伤血管夹夹闭肾动脉。暴露另一侧肾脏，夹闭动脉。双侧肾动脉夹闭期间，大鼠始终置于37摄氏度加热板上保持体温，腹部用生‐46‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用理盐水浸湿的无菌纱布覆盖。双侧肾动脉阻断60分钟后，取出双侧血管夹，3-0可吸收线关闭腹腔和肌肉层，4-0prolene缝线缝皮。清洁大鼠，放回鼠笼使之恢复。术后3天内皮下注射酮洛芬缓解疼痛（2-3mg/kg），根据大鼠脱水情况适当补充生理盐水。7天后拆除皮肤缝线。术后2周起，连续皮下注射100mg/kg庆大霉素5天，加重肾脏损伤。手术后，大鼠每2周随访血清肌酐，每4周随访GFR，共随访12周以确认慢性模型。12周内，大鼠血清肌酐持续上升至少50%认为慢性模型建立成功。此外，10只同年龄的大鼠不接受手术，作为对照（age-matchedcontrol,AMC）。3、尿源干细胞的注射：7培养和扩增尿源干细胞后，将细胞悬浮至5*10个/ml，并吹打成单细胞悬液，将细胞转入1ml注射器，置于冰上备用。手术在无菌的环境下进行，术者穿戴手术衣、口罩、帽子、鞋套以及无菌手套。造模成功的大鼠置于无菌铺巾上，在其下方放置加热板以保持体温。大鼠腹部用无痛碘消毒后，用15号刀片做腹部正中切口，剪开肌肉和筋膜，用拉钩暴露大鼠腹腔。将37摄氏度生理盐水浸湿的纱布放置于腹部切口一次，将大鼠肠道组织取出，置于润湿的纱布上，暴露一侧肾脏，取1ml注射器，震荡混匀细胞，安装30号针头，排空注射器内的空气，将针头插入大鼠肾脏皮质内，随机缓慢注射50ul细胞悬液或PBS（USC组或PBS组），注射完毕后，针头在肾脏组织内留置约1分钟以减少出血和细胞悬液或PBS漏出，拔出针头。肾上极和下极各注射一次。随后暴露对侧肾脏，以同样的方式注射尿源干细胞悬液或PBS。若肾脏出血，则压迫止血，压迫止血无效时行单侧肾切除术。观察1分钟，确认肾脏及腹腔内无出血后，用3-0可吸收缝线关闭腹腔和肌肉，4-0prolene缝线关闭皮肤。清洁大鼠，放回鼠笼使之恢复。术后3天内皮下注射酮洛芬缓解疼痛（2-3mg/kg），根据大鼠脱水情况适当补充生理盐水。7天后拆除皮肤缝线。此外，10只未进行造模的大鼠不注射细胞，作为对照（AMC组）。4、实验动物的随访：治疗后，所有实验动物每2周随访血清肌酐，每4周监测GFR。细胞注射后12周，处死所有大鼠，获取双侧肾脏进行研究。处死时，大鼠被置于密闭容器中，逐渐增加CO2浓度，直至大鼠完全停止呼吸，观察1分钟确认大鼠死亡后，将大鼠取出，进行颈椎离断后，获取双侧肾脏。肾脏称重后，置入10%福尔马林溶液固定24-48小时，随后将组织放入组织处理器进行脱水，石蜡包埋。用石蜡切片机将组织切成厚度为5um切片，60摄氏度烘烤2小时以蒸发水分，切片常温干燥环境下储存，供后续试验使用。5、HE染色法‐47‐ 第二军医大学博士学位论文（a）切片置于60摄氏度烤箱中烘烤30分钟，取出静置到恢复室温；（b）放置于100%的二甲苯中脱蜡15分钟，随后在100%至75%的酒精中各浸泡5分钟梯度水化，最后将切片置于自来水中；（c）Gill’s苏木精2分钟，将细胞核着色；（d）用自来水去除多余染色，Scott’s自来水冲洗1分钟使之泛蓝；（e）自来水冲洗2分钟，95%酒精浸泡1分钟；（f）伊红染色10-15秒；酒精去除多余染色；（g）酒精脱水、二甲苯透明，封片后显微镜下观察。6、健康肾单位计数：将符合以下条件的肾单位定义为“健康肾单位”：1）肾小球毛细血管薄且排列良好；2）内皮细胞和膜细胞数量正常；3）周围肾小管结构正常。每个实验动物选取3张HE染色切片，每张切片随机选取3个低倍视野（100X）进行计数，视野间至少距离50um以防止重复计数。7、Masson’s三色染色法：（a）切片置于60摄氏度烤箱中烘烤30分钟，取出静置到恢复室温；（b）放置于100%的二甲苯中脱蜡15分钟，随后在100%至75%的酒精中各浸泡5分钟梯度水化，最后将切片置于去离子水中；（c）切片置于Bouin固定液中室温固定过夜；（d）去离子水润洗2-3次；（e）Weigert式铁苏木精孵育10分钟；（f）自来水冲洗10分钟；（g）丽春红酸性品红液孵育2-3分钟，去离子水润洗2-3次；（h）1%磷钼酸水溶液孵育5-15分钟，期间显微镜下观察，胶原上的红色染料退掉即可；（i）倾斜切片去除多余的磷钼酸水溶液，将切片置于苯胺蓝溶液中染色5分钟；（j）去离子水润洗4-6次去除多余染料；（k）亮绿溶液复染2分钟；（l）酒精脱水、二甲苯透明，封片后显微镜下观察。8、肾脏切片的免疫组织化学染色：（a）切片置于60摄氏度烤箱中烘烤30分钟，取出静置到恢复室温；‐48‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用（b）放置于100%的二甲苯中脱蜡15分钟，随后在100%至75%的酒精中各浸泡5分钟梯度水化，最后将切片置于去离子水中；（c）切片置于250ml柠檬酸缓冲液中，加热溶液到98摄氏度并保持15分钟，取出切片，室温静置20分钟；（d）在切片上滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（e）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的A试剂，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（f）滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中的B试剂，室温孵育15分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（g）滴加蛋白封闭液，室温孵育20分钟；（h）一抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（i）倒掉蛋白封闭液，滴加一抗，4摄氏度孵育过夜；（j）PBS洗涤3次，每次10分钟；（k）生物素标记的二抗在抗体稀释液中稀释至适当浓度；（l）滴加二抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，每次10分钟；（m）滴加抗生物素蛋白生物素复合物，室温孵育30分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；（n）NovaRed显色，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片后显微镜下观察。9、统计学分析图像分析采用ImageJ进行分析。所有数据采用SPSS20.0formac进行统计学检验。数据的正态性采用Shapiro-Wilk检验。当数据呈正态分布时，数据均数±标准差的方式表达；3组间的比较采用单因素方差分析，各组两两之间的比较采用LSD检验。P<0.05时认为差别有统计学意义。‐49‐ 第二军医大学博士学位论文二、结果：1、大鼠血液样本和尿液样本的采集如图19所示：图19：大鼠血液样本和尿液样本的采集。A：尾静脉采血；B：收集尿液。2、动物模型的建立过程和结果：本实验共使用裸大鼠50只，其中正常对照10只，1只用于止血夹的测试，共对39只裸鼠进行了建模。39只接受双侧肾动脉阻断的裸鼠中，9只因无法耐受手术，于术后数天内陆续死亡。剩余的30只裸鼠中，18只在随访12周后保持了较高的血清肌酐水平，12只裸鼠的肾功能恢复，被剔除实验。18只模型被随机注射尿源干细胞或PBS，10只正常对照未接受任何处理。建模的过程如图20所示。3、尿源干细胞的注射：尿源干细胞注射过程顺利，术中未见明显细胞悬液或PBS渗漏，所有大鼠在术中均耐受手术。术中细胞或PBS注射过程如图21。术中可见模型大鼠肾脏表面粗糙、暗红，呈病理状态，与正常肾脏组织相比，更易吸纳所注射的液体。‐50‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图20：动物模型的建立过程。A：血管夹的测试，箭头所指为肾切除后被血管夹夹闭的肾动脉残端，可见血管夹功能良好，可完全夹闭肾动脉；B：正常的大鼠肾脏；C：阻断肾动脉后，缺血的大鼠肾脏；D：再灌注后的大鼠肾脏。图21：尿源干细胞或PBS注射。A：模型大鼠肾脏表面呈病理状态；B：尿源干细胞或PBS注射方式。‐51‐ 第二军医大学博士学位论文4、肾功能分析：三组动物（USC组、PBS组、AMC组）的血清肌酐水平变化见图22，三组间血清肌酐的差别有统计学意义（P<0.01）。USC组大鼠在接受细胞注射后2周内，血清肌酐水平迅速下降，4周后，血清肌酐水平趋于平稳，与PBS组间的差别有统计学意义（P=0.027）；USC组血清肌酐并未恢复到正常水平，与AMC组的差异存在统计学意义（P=0.02），肾功能恢复的程度为50%左右。PBS组在注射后的12周内，血清肌酐水平处于持续升高状态。GFR的变化趋势与血清肌酐类似（图23），USC组GFR的提高主要发生在4周以内，USC组GFR水平与PBS组、AMC组的差异均存在统计学意义，（P=0.037，P=0.005），此后各组GFR水平趋于平稳。图22：三组实验动物血清肌酐水平的变化。‐52‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图22：三组实验动物GFR水平的变化。5、肾脏组织形态学分析：收获三组实验动物肾脏后，发现其大体形态存在明显差异。AMC组肾脏质量较大，外观呈暗红色，表面光滑、均匀；USC组肾脏稍小，外观呈暗红色，表面欠光滑；PBS组肾脏质量明显减轻、体积减小，外观略带苍白，表面不光滑。三组肾脏大体形态及质量见图24。图24：肾脏大体形态及质量。A：三组肾脏的典型大体形态；B：三组肾脏质量，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。‐53‐ 第二军医大学博士学位论文（1）尿源干细胞示踪：采用HLA染色对尿源干细胞进行追踪（图25）。细胞注射12周后，接受细胞注射的肾脏中，HLA染色阳性的细胞数目很少，位置相对分散。个别细胞可能与肾小球的Bowman’s包膜融合。部分细胞散在于肾脏间质中，位于肾小管之间，未发现细胞与肾小管、肾小球毛细血管的融合。PBS组合AMC组的肾脏内未发现阳性细胞。图25：各组肾脏的HLA染色。A：USC组肾脏，可见HLA阳性细胞与Bowman’s包膜融合；B：USC组肾脏，可见HLA阳性细胞位于肾脏间质；C：PBS组肾脏，未见阳性细胞；D：AMC组肾脏，未见阳性细胞。（2）HE染色：HE染色可见AMC组肾脏肾小球结构正常、大小均匀，肾小球间距较为均匀，肾小管结构正常、排列紧密，肾脏组织内无纤维化形成。PBS组肾小球萎缩、数量减少、可见毛细血管分叶，肾小管管腔增大、腔内可见细胞脱落，肾脏组织内可见大量纤维增生。USC组肾脏结构位于AMC与PBS之间，肾小球数量较PBS组增多、形态尚规则，纤维增生少（图26）。‐54‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用AMC组、USC组、PBS组健康肾单位计数分别为10.7±2.49个/低倍视野、7.67±2.33个/低倍视野、3.83±1.76个/低倍视野。三组之间健康肾单位数量的差别有统计学意义（P<0.001），两两之间的比较发现USC组健康肾单位数量与AMC组、PBS组均存在统计学差异（P<0.05，图27）。图26：各组动物肾脏切片的HE染色。A：AMC组大鼠肾脏皮质（400X）；B：USC组大鼠肾脏皮质（400X）；C：PBS组大鼠肾脏皮质（400X）；D：AMC组大鼠肾脏髓质（400X）；E：USC组大鼠肾脏髓质（400X）；F：PBS组大鼠肾脏髓质（400X）图27：各组动物每低倍视野下正常的肾单位数，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。‐55‐ 第二军医大学博士学位论文（3）胶原沉积：在Masson’s三色染色法中，胶原被染成蓝色。AMC组肾脏中，可见正常的细胞外支架被染成蓝色；USC组肾脏中，皮质和髓质部分均有不同程度的胶原沉积、纤维化形成；PBS组肾脏胶原沉积最为严重，肾脏组织结构遭到破坏（图28）。通过ImageJ对胶原百分比进行分析，发现USC组肾脏胶原沉积较PBS组明显减少，但仍高于AMC组，差别具有统计学意义（图29，P<0.001）。一型胶原染色以及三型胶原染色结果中可见类似的结果。AMC组肾脏中，胶原沉积少，位于肾脏间质，轮廓清晰；USC组肾脏中，胶原沉积较多，位于肾脏间质，可见少量纤维化形成；PBS组肾脏中，胶原沉积最多，可见纤维组织中存在大量胶原沉积（图30，图31，P<0.001）。图28：各组动物肾脏切片的Masson’s三色染色。A：AMC组大鼠肾脏皮质（400X）；B：USC组大鼠肾脏皮质（400X）；C：PBS组大鼠肾脏皮质（400X）；D：AMC组大鼠肾脏髓质（400X）；E：USC组大鼠肾脏髓质（400X）；F：PBS组大鼠肾脏髓质（400X）图29：各组实验动物Masson’s三色染色中肾脏胶原沉积百分比，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。‐56‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用图30：各组实验动物肾脏一型胶原沉积。A：AMC组大鼠肾脏（200X）；B：USC组大鼠肾脏（200X）；C：PBS组大鼠肾脏（200X）；D：各组实验动物肾脏中一型胶原沉积百分比，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。图31：各组实验动物肾脏三型胶原沉积。A：AMC组大鼠肾脏（200X）；B：USC组大鼠肾脏（200X）；C：PBS组大鼠肾脏（200X）；D：各组实验动物肾脏中三型胶原沉积百分比，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。‐57‐ 第二军医大学博士学位论文（4）炎性细胞浸润：CD68为巨噬细胞的标志物，通过CD68抗体可将巨噬细胞的细胞核染色。AMC组肾脏中，可见间质中少量细胞CD68阳性，USC组中阳性细胞较多，而PBS组阳性细胞最多。在高倍镜下对CD68阳性细胞进行计数后发现，三组肾脏阳性细胞数量有统计学差异（图32，P<0.001）。图32：三组肾脏CD68染色。A：AMC组CD68染色（400X）；B：USC组CD68染色（400X）；C：PBS组CD68染色（400X）；D：CD68阳性细胞计数，P<0.001（*：与USC组的差别P<0.05）。三、讨论：良好的动物模型是研究慢性肾病的基础。研究间充质干细胞治疗慢性肾病的动物模11,62型以部分肾切除为主。然而，此模型最大的缺点在于所造成的慢性肾病不是系统性疾病；而临床上，糖尿病肾病等最常见的慢性肾病种类均为系统性疾病，因此，该模型的模拟效果不理想。此外，细胞的增殖以及肾功能的恢复需要一定空间，即肾脏需要具备较大的体积（包括损伤的组织），而在该模型中，肾脏部分切除后，体积急剧减小，‐58‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用干细胞失去了生长的“土壤”，其作用被大大削弱。缺血再灌注模型应用已久，但目前仍多用于急性肾病模型中。Wang等研究了缺血再灌注损伤在慢性模型中的作用，发现双侧肾动脉阻断60分钟时，可有效的长期损伤肾功能，动脉阻断时间增加，大鼠死亡1514率将明显提升。。Zager等研究了庆大霉素与缺血再灌注损伤的关系。发现庆大霉素可以使肾脏细胞内的能量动力学发生改变，加重缺血再灌注损伤。为了提高成模率，本实验中采用缺血再灌注损伤和药物诱导相结合的方法进行造模，采用较短的双侧肾动脉阻断时间从而提高大鼠生存率，并于术后2周起连续5天注射庆大霉素，有效的维持了缺血再灌注损伤导致的肾功能下降，提高了模型的成功率。注射尿源干细胞12周后，USC组内仍可看到少量细胞残留，部分细胞存在于肾小管之间的间质成分内，也有少量细胞可能与Bowman’s包膜融合，这种与肾脏组织结构融合的现象可能有利于肾功能的恢复。注射尿源干细胞后，模型大鼠的肾功能明显恢复，术后2周内，USC组大鼠血清肌酐显著降低，并在随后的2周内继续降低，于术后4周达到较好的水平；GFR也在术后4周明显升高。此后，USC组肾功能相对稳定，较PBS组约提高50%左右。在组织形态学方面，模型大鼠接受尿源干细胞注射后，肾脏结构改善、健康的肾单位数量增多、胶原沉积减少、肾简直炎性细胞浸润改善。虽然研究发现间充质干细胞对肾脏功能具有23,63改善作用，但具体机制目前尚不明了。我们在尿源干细胞注射2周后，观察到了明显的肾功能改善，而注射四周后，肾功能趋于平稳，因此尿源干细胞对肾功能作用发生在注射早期。由第二部分的结果可见，尿源干细胞在注射早期可能尚未分化成为肾脏细胞，且较难与肾脏组织结构发生融合。同样的结果也在羊水干细胞中也得到了印证。Rota13等将羊水干细胞注射入小鼠急性肾病模型中，并随访31天。虽然肾功能有所改善，但羊水干细胞在31天后仍位于肾脏间质内，尤其位于肾小管之间，并处于未分化的状态。尿源干细胞对肾功能的改善可能与其分泌的生长因子有关。注射尿源干细胞后，Masson’s三色染色法提示肾间质胶原沉积减少。一型胶原为陈旧性胶原沉积，而三型胶原多为新形成的胶原。将胶原沉积分类后，通过相应抗体对肾脏切片进行染色，结果提示USC组肾脏两种胶原的沉积均较PBS组有明显改善（P<0.05）。陈旧的一型胶原数量减少，可能预示着尿源干细胞分泌的某些生物活性因子对胶原具有重构的功能，将这些纤维化局域释放出来，从而给予肾脏更多再生的空间。而三型胶原数量的减少可能提示肾脏在注射尿源干细胞后纤维化的程度减轻。USC组一型胶原和三型胶原的数量与AMC组无统计学差异。尿源干细胞分泌生物活性因子还表现在免疫调节方面，USC组肾脏间质炎性细胞浸润的程度较PBS组有所减轻（P<0.05）。有学者认为，干细胞对肾功能的改善作用主要来自于其分泌的物质，与细胞本身关系较小。为了证明这一假说，‐59‐ 第二军医大学博士学位论文64vanKoppen等将普通胚胎间充质干细胞培养基或胚胎间充质干细胞预处理的培养基注射入部分肾切除造成的大鼠慢性肾病模型中，经过6个周的随访，他们发现，注射预处理过的培养基的大鼠肾功能较对照组有所改善，GFR提高、蛋白尿减少、收缩压降低、组织学上肾小球及肾小管损伤情况减轻。尿源干细胞治疗慢性肾病最重要的优势在于其获取方式无创，且可以多次收集。不同于其他来源的间充质干细胞，尿源干细胞来源于新鲜尿液，获取方式简单、无创，减轻患者的痛苦。与此同时，尿源干细胞可通过多次收集小便从而获得大量的起始细胞，减少体外增殖的时间，保证尿源干细胞的纯度和干性处于较好的状态。当然，对于尿源干细胞的应用也存在一定的问题，最重要的在于慢性肾病患者尿液中是否还存在尿源干细胞。本实验室收集糖尿病肾病患者的尿液尝试分离尿源干细胞，发现每100ml尿液中的尿源干细胞克隆数升高，且形态、活性与健康供体中获得的克隆类似（结果未发表）。但终末期肾病患者尿液中是否仍能获取尿源干细胞目前尚无相关研究。尿源干细胞治疗慢性肾病也有很多后续工作需要开展。例如，细胞注射的方式对预后可能产生影响。常用注射方式将细胞直接注射入肾脏皮质，或注射入循环系统。注射入皮质的又是在于可在肾脏中集中大量的干细胞，缺点在于由于注射时压力难以控制，可导致局部出血，甚至细胞团进入循环系统，从而形成栓子；循环系统注射可减少细胞团块的产生，使细胞均匀的分散在肾脏中，但肾脏中募集到的细胞量较少。另外，在本实验中，USC组虽然肾功能有所改善，但仍未达到正常水平。本研究发现尿源干细胞注射2周后肾功能迅速改善，4周内肾功能持续恢复，4周后肾功能趋于稳定，在4周后再次注射尿源干细胞是否有利于进一步提高肾功能有待探讨。此外，尿源干细胞改善肾功能的机制尚不明确，除了以上提到的分泌生物活性物质之外，分化并不能排除，且尿源干细胞在注射到肾脏中之后，可能具备召集其它修复性细胞的作用。最后，多种干细21,65,66胞均可参与肾功能重建，如何选取最高效的细胞种类，同时减少副作用、对患者的创伤、并避免伦理问题也是重要的研究方向。总之，尿源干细胞对慢性肾病大鼠模型的肾功能存在修复作用，其机制及优化的治疗手段需要进一步的研究。‐60‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用全文结论本研究成功的从健康供体的尿液中获取了尿源干细胞，通过自我更新、多向分化、干细胞表面标志物等方面对获取的尿源干细胞进行鉴定，证实尿源干细胞属于间充质干细胞家族。通过向裸小鼠肾脏内注射尿源干细胞发现，尿源干细胞可在肾脏中存活，但再短期内尚未分化成为肾脏细胞。通过建立慢性肾病大鼠模型，并向其注射尿源干细胞/PBS发现，尿源干细胞对慢性肾病有改善作用，接受干细胞注射的模型血清肌酐降低，GFR升高，肾脏结构改善，胶原沉积减少，炎性细胞浸润减少；尿源干细胞改善肾功能可能主要依靠其分泌的生物活性物质。总之，尿源干细胞可能对慢性肾病有改善作用，可能成为无创的、自体的治疗慢性肾病的新的细胞来源，其作用机制和优化的治疗手段仍需要进一步的研究。‐61‐ 第二军医大学博士学位论文参考文献：1.K/DOQIclinicalpracticeguidelinesforchronickidneydisease:evaluation,classification,andstratification.AmJKidneyDis2002;39:S1-266.2.XuR,ZhangL,ZhangP,etal.Comparisonoftheprevalenceofchronickidneydiseaseamongdifferentethnicities:BeijingCKDsurveyandAmericanNHANES.NephrolDialTransplant2009;24:1220-1226.3.BaumgartenM,GehrT.Chronickidneydisease:detectionandevaluation.AmFamPhysician2011;84:1138-1148.4.CoreshJ,SelvinE,StevensLA,etal.PrevalenceofchronickidneydiseaseintheUnitedStates.Jama2007;298:2038-2047.5.CoreshJ,EknoyanG,LeveyAS.Estimatingtheprevalenceoflowglomerularfiltrationraterequiresattentiontothecreatinineassaycalibration.JAmSocNephrol2002;13:2811-2812;authorreply2812-2816.6.BarretoFC,BarretoDV,MoysesRM,etal.K/DOQI-recommendedintactPTHlevelsdonotpreventlow-turnoverbonediseaseinhemodialysispatients.KidneyInt2008;73:771-777.7.LiuJ,HuangZ,GilbertsonDT,etal.Animprovedcomorbidityindexforoutcomeanalysesamongdialysispatients.KidneyInt2010;77:141-151.8.BenigniA,MorigiM,RemuzziG.Kidneyregeneration.Lancet2010;375:1310-1317.9.VyasS,RobertiI.LymphocyteATPimmunecellfunctionassayinpediatricrenaltransplants:isituseful?TransplantProc2011;43:3675-3678.10.GoAS,ChertowGM,FanD,etal.Chronickidneydiseaseandtherisksofdeath,cardiovascularevents,andhospitalization.NEnglJMed2004;351:1296-1305.11.CaldasHC,FernandesIM,Kawasaki-OyamaRS,etal.Effectofstemcellsseededontobiomaterialontheprogressionofexperimentalchronickidneydisease.ExpBiolMed(Maywood)2011;236:746-754.12.BeckerGJ,HewitsonTD.Animalmodelsofchronickidneydisease:usefulbutnotperfect.NephrolDialTransplant2013;28:2432-2438.13.RotaC,ImbertiB,PozzobonM,etal.Humanamnioticfluidstemcellpreconditioningimprovestheirregenerativepotential.StemCellsDev2012;21:1911-1923.14.ZagerRA.Gentamicineffectsonrenalischemia/reperfusioninjury.CirculationResearch1992;70:20-28.15.WangHJ,VarnerA,AbouShwarebT,etal.Ischemia/reperfusion-inducedrenalfailureinratsasamodelforevaluatingcelltherapies.RenFail2012;34:1324-1332.16.YamaleyevaLM,Guimaraes-SouzaNK,KraneLS,etal.Celltherapywithhumanrenalcellcultures‐62‐ 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尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用文献综述肾脏的再生医学研究进展摘要：修复和重建受损的肾脏组织是泌尿外科重要的课题。再生医学作为新兴学科，今年来迅速发展，可能成为治疗肾病，尤其是终末期肾病的手段之一。本文将就细胞、材料在肾脏再生中的应用以及肾脏再生医学的研究进展作一综述。关键字：再生医学，组织工程，干细胞，肾病，肾功能衰竭。RegenerativemedicineinkidneyAbstract:Repairandreconstructionofdamagedkidneyhasbeenamajorissueinthefieldofurology.Regenerativemedicine,asarapidevolvingtechnology,mayofferanalternativetreatmentandhopeforpatientswithkidneydiseases,especiallyend-stagekidneydisease.Thisarticlewilldiscusstheroleofcellsandmaterialsinrenalregenerationaswellasthestatusofcurrentstatusofregenerativemedicineforthegenerationofkidney.KEYWORDS:regenerativemedicine,tissueengineering,stemcells,kidneydisease,renalfailure.‐67‐ 第二军医大学博士学位论文肾脏疾病可大致分为急性肾病和慢性肾病。大多数急性肾病患者可以恢复，而部分患者肾功能无法完全恢复正常，甚至继续进展成为慢性肾病和终末期肾病。对于急性肾1病患者，即使采用先进的治疗手段，死亡率仍高达25%~70%，成为创伤、复杂手术后23以及重症监护室患者的巨大威胁。另一方面，全世界约13%的人口患有慢性肾病，尤其是终末期肾病，给个人和社会造成了沉重的负担。仅在2009年，美国11余万新患者开始终末期肾病的治疗，终末期肾病的医疗花费达到420亿美元，占到政府医疗开支的45.9%。目前针对终末期肾病的治疗方式主要有透析和肾移植。透析明显降低患者生活质量，并占用大量的医疗资源；供体的短缺严重制约了肾移植的开展，且免疫抑制剂的使用增加了患者肿瘤的风险。近年来，再生医学的迅速发展给患者带来了新的希望。受损组织和器官的修复及重建一直是医学领域的重要课题。病灶切除（Resection），自体组织修复（Repair）和异体组织移植（Replacement）是传统外科的三个“R”。然而，自体组织移植常常受到供体部位条件的限制，且可能造成供体部位的继发性损伤。异体组织移植受到供体器官短缺的限制，可能引起排异反应，并且长期服用免疫抑制剂可能肿瘤发病率升高。因此，研究者开始研究再生医学（Regeneration）在修复受损器官中的作用，从而成为外科领域的第四个“R”。再生医学替代或再生人体细胞、组织或器官，5从而恢复或重建组织或器官的正常功能。再生医学是一个快速发展的领域，他囊括了6组织工程、细胞生物学、生物化学、材料科学以及众多其他学科。在重建组织器官功7能方面，目前主要有三条途径：1）细胞疗法。通过活检获取自体或异体的细胞后在体外培养，扩增后注入体内。2）在体内植入生活材料或合成材料，指导组织的再生过程。3）将细胞种植在支架上，并植入体内。肾脏结构复杂，功能多样，是再生医学中重建难度最大的器官之一。本文将就细胞、材料在肾脏再生中的应用以及肾脏再生医学的研究进展作一综述。细胞在肾脏再生中的应用内源性原代细胞是最好的细胞来源之一。使用这些细胞能够有效的避免组织排异，并减轻炎性反应。已有的研究显示，获取肾脏原代细胞，在体外培养扩增后，将原代细8胞注射入慢性肾病大鼠模型的肾脏实质内，可有效改善肾功能。接受肾脏原代细胞注射的大鼠相比对照组血清肌酐以及尿蛋白水平下降，血红蛋白水平提高，组织学上肾小球萎缩有所好转，胶原沉积及炎性细胞浸润的程度均有所减轻。使用内源性原代细胞最大的限制可能来源于细胞数量。由于原代细胞在体外的生命周期较短，扩增至具有治疗作用的细胞数量较为困难。更重要的是，在已经受损的器官上获取细胞，可能对该器官造成进一步的损害，且由于器官处于疾病状态，健康细胞的数量可能不足以满足临床应9用需要。然而，GeorgeSK等从正常肾脏以及慢性肾病的肾脏组织中获取原代细胞，‐68‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用并在体外进行培养。这些细胞表现出了相似的形态和增值模式。钠摄入和白蛋白摄入等功能学分析显示，两种细胞在体外的功能表现类似（资料来源：2013年美国泌尿外科年会摘要）。因此，即使来源于肾病肾脏的细胞，也可能被应用于细胞疗法中。成人干细胞存在于成年人的组织和器官中。人体稳态的维护以及创伤后的修复是成10人干细胞增值和分化的结果。截至目前，几乎人体所有的组织器官中都发现了成人干11细胞。应用成人干细胞的优势主要为：1）细胞为自体细胞，避免了排异，并减轻炎性反应。2）成人干细胞的应用不存在伦理问题。3）根据部位，某些成人干细胞的获取12,13相对容易。4）成人干细胞在体内不形成畸胎瘤。多种成人干细胞对肾脏修复有益。Villanueva等将骨髓间充质干细胞注射入患有慢性肾病的小鼠体内，随访后发现小鼠肾脏结构、纤维化和炎性细胞浸润程度均有所好转。然而，成人干细胞在体内的含量较少，在体外保持无分化增值相对困难，成为成人干细胞应用于临床的挑战。14胚胎干细胞来源于囊胚期内细胞团，有两个重要的特征：更够通过有丝分裂无限增殖并保持未分化状态，即自我更新能力；更够分化成为来源于内胚层、中胚层、外胚15层来源的众多种类的细胞。由于具备这些特性，胚胎干细胞已被成功诱导，并产生大16,17量的各种类型的细胞。Ross等把小鼠来源的胚胎干细胞种植在去细胞的肾脏支架上，18观察到了胚胎干细胞的增殖和分化。证明胚胎干细胞在适当条件下，可能分化成为各种肾脏细胞，形成相应结构，从而重建肾功能。胚胎干细胞的应用也存在一些问题。早期的胚胎干细胞获取过程中，需要小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层来提供适当的支撑以及14生长因子。然而，在临床应用中，胚胎干细胞的获取、培养、分化过程不应有异种物19质参与（xeno-free），且应在良好作业规范下进行（GMP）。目前，来源于人的饲养层20-22已取代了小鼠胚胎成纤维细胞，不需要饲养层的胚胎干细胞获取技术也已经成熟。这些方法均有助于减少异种污染的风险。由于胚胎干细胞的获取过程需要破坏囊胚，因而应用一直受到伦理和政策法规的限制。肿瘤风险也是另外一个制约胚胎干细胞应用的因素，去除残留的多能干细胞、去除肿瘤特异性的基因以及肿瘤的早期发现、早期治疗，23是目前研究的主要方向。为了获取多能干细胞的同时不破坏胚胎，众多研究转向了多能干性诱导因子。2006年，Takahashi和Yamanaka率先将4个转导因子（OCT3/4，SOX2，c-MYC，KLF4）24转入鼠的成纤维细胞中，成功的将这些细胞诱导成为多能干细胞。这些细胞与胚胎干细胞在形态学、表面标志物、增殖特性、分化潜能等方面类似。目前，肾小管细胞已被2526成功的诱导成为多能干细胞，诱导干细胞也已经成功的分化成肾脏足细胞，同时诱27导多能干细胞已被用于治疗糖尿病肾病的研究。虽然多能诱导干细胞的应用不存在伦理障碍，但也有问题需要解答和改善。C-MYC作为4个转导基因之一，同时也是重要28的原癌基因，去除c-MYC是预防肿瘤生成的重要步骤。Yu等采用不含c-MYC的转‐69‐ 第二军医大学博士学位论文导因子组合诱导了多能干细胞（OCT4，SOX2，NANOG，LIN28），但诱导效率有所下29降。其他的转导因子组合也有报道。转导因子通常通过逆转录病毒、慢病毒进行转染，然后，大量地向基因组总导入外源性基因可能导致插入突变以及内源性原癌基因激活。30-32可能的解决办法是采用腺病毒等一过性的转染或不依赖病毒的转染方法。相较于胚胎干细胞，多能诱导干细胞有一些优势。1）诱导多能干细胞的获取相对简单。胚胎干细胞的获取需要分离囊胚期内细胞团，成功率较低，而诱导多能干细胞的获取方法已较为成熟。2）诱导多能干细胞可来源于自体细胞，从而避免组织排异。羊水干细胞是胎儿干细胞的重要代表。鉴定工作最完善羊水干细胞在2007年产生33。羊水干细胞可通过对表面标志物c-kit进行阳性分选获得，能够在无饲养层的情况下倍增250次，并保持较长的端粒酶和正常的表型。这些c-kit阳性的细胞约占羊水细胞34总数的1%左右。羊水干细胞同时表达胚胎干细胞的表面标志物（例如SSEA-4和OCT4）和间充质干细胞的表面标志物（例如CD29，CD44，CD73，CD90，CD105），表明羊水35干细胞是处于胚胎干细胞和成人干细胞之间的一种细胞表型。Rota等将羊水干细胞注射到顺铂诱导的急性肾功能衰竭的小鼠模型中，发现羊水干细胞对保护肾功能和降低小鼠死亡率有效，随访31天后，羊水干细胞主要位于肾小管旁的间质区域，并表现出抗凋亡的特性。与胚胎干细胞不同，羊水干细胞的应用不存在伦理问题，在体内也不产生36畸胎瘤。因此，可作为自体细胞终生储存，以治疗危及生命的疾病。尤其在小儿肾脏病方面，当诊断先天性肾脏损伤时，可通过羊水穿刺获取、扩增和分化羊水干细胞，用于随后的肾脏功能恢复或重建。细胞在肾脏再生的过程中起到至关重要的作用，内源性原代细胞、成人干细胞、胚胎干细胞、多能诱导干细胞、羊水干细胞等都在肾脏再生中得到了应用。其中，间充质37干细胞已进入一期实验阶段（NCT00733876），而更多的研究尚处于临床前期。材料在肾脏再生中的应用生物材料主要作为细胞外支架，为细胞提供支撑和粘附力，也可以装载生长因子、细胞因子等生物活性物质，从而使细胞更好的生长。生物材料可大致分为三类：自然来38源的材料，去细胞支架以及合成材料。胶原是应用最为广泛的自然来源材料，可以从动物组织中提取，是体内广泛存在的重要蛋白。此外，海藻盐、明胶和纤维蛋白也是常39用的材料，交联后的明胶降解速度减慢，可能成为肾脏再生的良好生物材料。自然来源的材料通常生物相容性较好，且可降解，因此被用在再生医学的各个领域。但是，无损伤的改变自然来源材料的生物化学特性较为困难，某种程度上限制了应用。去细胞膀胱组织和去细胞小肠组织是再生医学中常用的去细胞支架。膀胱和小肠的细胞成分可能在移植后引起免疫反应，去细胞通常使用清洁剂，仅保留细胞外的支架，其生物化学特‐70‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用性可通过不同的去细胞方法调节。Reing等测试了多种去细胞方法，发现使用胰蛋白酶/十二烷基硫酸钠/TritonX-100进行脱细胞减少了支架的生长因子，并降低了支持功能；40而使用胰蛋白酶/TritonX-100时可增加支架的支持功能。肾脏也可进行去细胞，从而41获得器官的支架结构。Orlando等采用十二烷基硫酸钠为基础的去细胞方法，成功的对猪和人的肾脏进行去细胞，保留了完整的支架和血管结构。这些支架可能成为未来肾脏再生的重要材料。自然来源的材料和去细胞支架有着共同的缺陷：1）难以大量的获取。2）不同批次获得的支架，质量难以保证均一。相反，合成材料可广泛工业生产，且特性容易控制。乙醇酸衍生物，乳酸衍生物，共聚物已被应用在包括肾脏在内的一系列支架中。合成材料的主要缺点在于缺少生物活性因子，因此在合成材料中加生物活性因子或自然来源的材料逐渐受到重视。理想的生物材料应有良好的生物相容性。生物相容性包括炎性反应、机械特性、生物活性物质的释放、营养物质的传递等。这些因素将引导细胞粘附、细胞分化，并最终42决定植入的组织是否能够维持适当的功能。在这方面，自然来源的材料和去细胞支架有重要优势，同时，很多合成材料的特性可以修饰，从而提高生物相容性。理想的生物材料应可在适当的速率下进行生物降解，且降解过程中不产生有毒副产品。降解速率应与再生速率一致，降解过快可能导致对细胞的支持以及生长因子分泌不足；降解过慢可43能导致阻塞和炎症，从而影响再生的过程。越来越多的研究提示，细胞外支架在调节细胞功能和行为方面可以起到重要的作用，包括基因表达、增殖、迁移、分化以及细胞存活等等。含有成纤维细胞的支架常被用于皮肤重建。迁移刺激因子是一种重要的细胞因子，表达迁移刺激因子的成纤维细胞具备44更大的扩增和延展能力。正常皮肤中获取的成纤维细胞无论在体内还是体外都不表达迁移刺激因子，迁移刺激因子的表达可通过一过性的肿瘤生长因子β1处理来诱导。然44而，这种诱导只有细胞被种植在“伤口”（例如变性的一型胶原）上时才能成功。该研究说明支架对细胞的功能起到重要的作用。未来的肾脏再生的研究需要把更多的精力投入细胞与支架的相互作用之中。肾脏再生的研究进展由于结构和功能复杂，肾脏成为人体内最难重建的器官之一。滤过是肾脏最重要的功能，这一功能的实现依靠着极为复杂的血管系统和众多的细胞种类。此外，促红细胞生成素分泌等功能也十分重要。为了重建功能完整的肾脏，必须保留肾小球的微血管结构，并将适当数量的不同类型的肾脏细胞放置于适当的位置上。肾功能可通过体外或体内手段替代。透析是最常见的体外替代肾功能的手段，然而透析成本高昂，明显降低患45者生活质量。此外，透析仅替代肾脏的滤过功能，而无法替代内分泌等功能。Humes‐71‐ 第二军医大学博士学位论文46等通过体外的肾小管辅助装置替代了肾功能。他们使用了含有中空纤维的血液滤过装置作为支架，并在中空纤维的内壁种植来源于猪的近曲小管上皮细胞。然后，该装置与急性肾功能衰竭的动物模型相连接，以期替代其肾功能。除了滤过功能之外，作者通过葡萄糖水平评价转运功能，采用维生素D分泌评价内分泌功能。采用肾小管辅助装置后，血钾和血尿素氮水平明显改善，并发现了主动的葡萄糖重吸收以及维生素D分泌。这些47结果显示，肾脏的众多功能可以在体外进行替代。类似的装置也应用于了临床试验。患有急性肾功能衰竭的患者被随机分入两组：肾小管辅助装置组或传统连续性肾脏替代治疗。结果表明接收肾小管辅助装置治疗的患者生存率较高，且肾功能的回复情况也较好。更多的情况下，肾功能的重建在体内进行。细胞疗法是应用于肾脏再生的常见方法，内源性原代细胞、成人干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎儿干细胞等等几乎各类细胞均在改善肾脏功能方面得到了应用。骨髓来源的细胞是肾脏再生中研究较多，也48,49较为成熟的细胞类型。研究证明，向奥尔波特综合征小鼠模型注射骨髓来源的细胞改善了小鼠的肾功能，组织学检查发现，小鼠的肾小球、肾小管纤维化均有不同程度的50好转。研究也表明，骨髓来源的细胞在人体中，也参与了肾小管的修复过程。Sun等51通过结扎小鼠输尿管的方式诱导肾间质纤维化，在手术的同时，通过静脉向部分小鼠注射了羊水干细胞，在术后不同时间处死小鼠并研究肾脏结构的变化。发现注射的羊水干细胞可以提高血管内皮生长因子水平，降低缺氧诱导因子1a和肿瘤生长因子b1的表达，从而减轻肾间质纤维化，保护肾功能。除了将细胞直接注射之外，预处理的细胞可能对改善肾功能有着更好的效果。Rota等采用胶质细胞源神经生长因子（glialcellline–derivedneurotrophicfactor，GDNF）预处理羊水干细胞，并将接受以及未接受GNDF处理的细胞分别注射入急性肾衰小鼠模型，结果显示接受GNDF处理的羊水干细胞对肾功35能的改善优于未处理的，肾脏内的增值细胞数量也更多。绝大多数的研究提示，细胞对肾脏的修复作用主要来源于被注入细胞分泌的生长因子、细胞因子以及其局部的免疫37调节作用，而非细胞分化和融合。因此，使用干细胞预处理的培养基进行治疗，培养基内含有治疗肾病所需的生物活性因子，同时不含细胞成分，可大大降低排异和炎性反应。VanKoppen等证实了这一设想，他们将间充质干细胞预处理过的培养基注射入慢52性肾病大鼠模型，发现大鼠的肾小球滤过率提高，肾小球损伤明显改善。这可能成为肾脏疾病细胞疗法的新方向。支架种植细胞后形成的人工肾脏也可以在体内对肾脏进行重建、解决器官短缺的问题，采用自体肾脏细胞，更可以减轻排异和炎性反应。采用支架和诱导的干细胞是设计人工肾脏的途径之一，为了完成这一目标，必须选取适当的细胞、支架以及最优的培养环境。肾脏支架可通过脱细胞的方法获得。为了实现该途径，Sullivan等采用0.25%十‐72‐ 尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用二烷基硫酸钠、0.5%十二烷基硫酸钠以及1%TritonX-100对猪的肾脏进行脱细胞，比较53了三种方法的可行性和有效性。实验结果表明，0.5%十二烷基硫酸钠脱细胞有效，并且形成了成熟的脱细胞方案。研究者们试图在脱细胞后的肾脏支架上种植肾脏细胞，以18期替代肾功能。在初步实验中，Ross等对大鼠肾脏进行脱细胞，保留了其复杂的结构，并通过输尿管或肾动脉将鼠来源的胚胎干细胞接种在支架上。之后，研究者在肾小球、肾小管以及血管结构中均观察到了细胞增殖。胚胎干细胞逐渐丢失干细胞表形，开始表达分化后的表面标志物。未与基底膜接触的细胞逐渐凋亡，从而形成管腔。完全分54化后的肾脏原代细胞也是重建肾脏的重要细胞来源。Song等在去细胞的过程中保留了皮质、间质以及血管结构，随后在去细胞支架上种植内皮和上皮细胞，得到的人工肾脏置于生物反应器中可以产生初步的尿液。将人工肾脏移植到体内之后，肾脏灌注良好，未出现内出血的现象，其产生的尿液在肌酐水平、尿素氮水平等方面均高于未种细胞的支架，实验动物的尿糖和尿蛋白有所减少。肾功能的体外替代、体内细胞疗法以及体内人工肾脏移植是目前肾脏发展的重要方向，尤其是体内细胞疗法以及人工肾脏移植，目前以成为研究的焦点。在细胞疗法方面，如何从众多种类的细胞中选取最优的细胞，并进一步探索其修复肾脏功能的机制是目前亟待解决的问题。在人工肾脏方面，如何无损的脱细胞、保留复杂的血管结构和支架内的生物活性因子目前仍是难题，如何高效率的诱导干细胞分化尚有巨大的研究前景。总结肾脏的再生医学研究是个迅速发展的学科，从简单的肾功能修复到复杂的器官重建均产生了令人振奋的结果和发现，许多新理论甚至推翻了传统的医学理念。另一方面，肾脏再生在临床方面的研究尚处于初始阶段，虽然个别研究成果以进入临床实验，但仍然不是标准的治疗方案；更多的技术尚处于临床前期和基础实验阶段。要把更多再生医学的手段转化到临床，研究者们需要提供优于目前治疗手段的方法，以及可靠、可重复的实验数据。目前的研究提示，再生医学有着良好的研究和应用前景，可能成为治疗肾病，尤其是终末期肾病的重要手段。‐73‐ 第二军医大学博士学位论文参考文献：1.SinghAP,JunemannA,MuthuramanA,etal.Animalmodelsofacuterenalfailure.PharmacolRep2012;64:31-44.2.LameireN,VanBiesenW,VanholderR.Thechangingepidemiologyofacuterenalfailure.NatClinPractNephrol2006;2:364-377.3.BenigniA,MorigiM,RemuzziG.Kidneyregeneration.Lancet2010;375:1310-1317.4.CollinsAJ,FoleyRN,ChaversB,etal.'UnitedStatesRenalDataSystem2011AnnualDataReport:Atlasofchronickidneydisease&end-stagerenaldiseaseintheUnitedStates.AmJKidneyDis2012;59:A7,e1-420.5.MasonC,DunnillP.Abriefdefinitionofregenerativemedicine.RegenMed2008;3:1-5.6.AtalaA.Tissueengineeringofreproductivetissuesandorgans.FertilSteril2012;98:21-29.7.HorstM,MadduriS,GobetR,etal.Engineeringfunctionalbladdertissues.JTissueEngRegenMed2013;7:515-522.8.YamaleyevaLM,Guimaraes-SouzaNK,KraneLS,etal.Celltherapywithhumanrenalcellculturescontainingerythropoietin-positivecellsimproveschronickidneyinjury.StemCellsTranslMed2012;1:373-383.9.AtalaA.Bioengineeredtissuesforurogenitalrepairinchildren.PediatrRes2008;63:569-575.10.IlicD,PolakJM.Stemcellsinregenerativemedicine:introduction.BrMedBull2011;98:117-126.11.daSilvaMeirellesL,ChagastellesPC,NardiNB.Mesenchymalstemcellsresideinvirtuallyallpost-natalorgansandtissues.JCellSci2006;119:2204-2213.12.VillanuevaS,EwertzE,CarrionF,etal.Mesenchymalstemcellinjectionameliorateschronicrenalfailureinaratmodel.ClinSci(Lond)2011;121:489-499.13.VillanuevaS,CarrenoJE,SalazarL,etal.Humanmesenchymalstemcellsderivedfromadiposetissuereducefunctionalandtissuedamageinaratmodelofchronicrenalfailure.ClinSci(Lond)2013;125:199-210.14.ThomsonJA.EmbryonicStemCellLinesDerivedfromHumanBlastocysts.Science1998;282:1145-1147.15.BrivanlouAH,GageFH,JaenischR,etal.Stemcells.Settingstandardsforhumanembryonicstemcells.Science2003;300:913-916.16.MauneyJR,RamachandranA,YuRN,etal.All-transretinoicaciddirectsurothelialspecificationofmurineembryonicstemcellsviaGATA4/6signalingmechanisms.PLoSOne2010;5:e11513.17.SchwartzSD,HubschmanJ-P,HeilwellG,etal.Embryonicstemcelltrialsformaculardegeneration:apreliminaryreport.TheLancet2012;379:713-720.18.RossEA,WilliamsMJ,HamazakiT,etal.Embryonicstemcellsproliferateanddifferentiatewhenseededintokidneyscaffolds.JAmSocNephrol2009;20:2338-2347.19.UngerC,SkottmanH,BlombergP,etal.Goodmanufacturingpracticeandclinical-gradehumanembryonicstemcelllines.HumMolGenet2008;17:R48-53.‐74‐ 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尿源干细胞在治疗慢性肾病大鼠模型中的应用致谢落笔于此，意味着三年博士研究生阶段即将结束，在这宝贵的时光中，我增长了知识、开阔了视野，回首过往的点点滴滴，导师的教诲、老师们的指点、师兄弟的帮助历历在目，不禁感慨万千，感激之情溢于言表。首先，我要将最诚挚的敬意献给我最尊敬的导师孙颖浩教授。早在硕士研究生阶段便领略了您高超的外科技术、严谨的科研精神和潇洒的人格魅力。三年前，义无反顾的报考您的博士研究生，并幸运的被录取。三年来，您对学生严爱并施，悉心指导。每次向您汇报和讨论课题，都能茅塞顿开的找到攻克难关的方向；每次与您交流，都能感受到您对学生无微不至的关怀；每次聆听您的训诫，都能感受到您的良苦用心。您言传身教，不仅教导学生如何成为一名优秀的医生和科研工作者，更教会学生如何做人，您的每一句话，学生都铭记在心，能成为您的学生，是我一生之幸。我要特别感谢许传亮教授、王林辉教授在科研和临床工作中对我的帮助，在我困惑的时候指点迷津。感谢侯建国教授、高旭教授、高小峰教授、杨波教授、周铁教授、杨庆教授在临床工作中给我的锻炼机会。感谢仁善成老师在实验思路方面的指导。感谢万鹏护士长、盛夏护士长、陈欣护士长给我的关怀。感谢张振声老师在留学阶段对我的帮助。感谢实验室成艳琼老师、施爱华老师、矫力老师、朱潋慧老师、乔萌老师、翟蓓蓓老师在实验技术方面的指导。感谢刘志勇老师、叶华茂老师、刘冰老师、徐斌老师、王海峰老师、王辉清老师、朴曙光老师、李凌老师、彭永涵老师、鲁欣老师、王燕老师对我思想上的点拨。感谢师兄弟曾钦松、徐伟东、陈光华、孙毅、景泰乐、王富博、吕骥、沈剑、吴震杰、吴承耀、赵俊杰、陈锐在日常工作及论文撰写中给予我的帮助。我会将你们的支持放在心底，愿友谊日久天长。感谢爱妻给予我的支持，在我喜悦的时候与我分享，在我低落的时候将我搀扶、共同奋斗。感谢岳父母不远万里来到我们身边照顾妻儿，使我能够全力投入实验、完成课题。最后我要感谢我的父母。不当家不知柴米贵、不养儿不知父母恩。如今我已为人父，更能体会你们对儿子含辛茹苦的培养。感谢你们把我带到这个世界，让我感受到幸福与甜蜜。再次感谢所有关心、支持、帮助过我的人，在此一并叩谢！‐79‐