酚：氯仿：异丙醇抽提核酸的一些问题

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1、酚：氯仿：异丙醇抽提核酸的一些问题2014-01-423:191.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效

2、。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。异丙醇：优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处

3、，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤。2.一般用的是酚：氯仿：异丙醇为25：24：1（v/v），其中酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，3.本身酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白质步骤：质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30min后12000r/min离心10m

4、in，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于20～40微升去离子水中或者0.5mol/LpH8.0的TE中。1.酚/氯仿法提取DNA的原理1)酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。2）氯仿的作用：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后

5、用氯仿抽提：去除核酸溶液中的过量酚。（酚易溶于氯仿中）3）用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4）用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。5)酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞D

6、NA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚－氯仿抽提

7、细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇注意不是异丙醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间