核酸抽提的一些基础知识解答.doc

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1、核酸抽提的基础近H撰写了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会有点凌乱。首先声明的是：这篇东四只为有一定核酸抽提基础知识的人准备,同时也将会及时修改。那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的吋间。写这篇东西的另外一个原因是，我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提程序。最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步；DNAzol将这三步并成了一步，按道理己经简化到了极致。事实是，DNAzol并没有被大家认可，其原因大概还是质量不太可靠吧。现在也有使用

2、ProteinaseK消化后直接沉淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除ProteinaseKo明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落屮国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。1、核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品屮的核酸游离在裂解体系屮的过程，纯化则是使核酸与裂解体系屮的其它成分，如蛋口质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、TritonX-100>NP・40、Tween20等）和盐（如T

3、ris、EDTA、NaCl等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris）,还包括抑制样品屮的核酸酶在裂解过程屮对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。去污剂则是通过使蛋口质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋口质，从而实现核酸游离在裂解体系屮。裂解体系屮还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后而的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT.GuHCl等）裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是DN

4、A抽提的主流。最常用的纯化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质,在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，血不吸附蛋口质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。其它杂质■如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的

5、试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。2、裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组DNA的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA相连接的蛋白质的游离。蛋口酶的作用是使蛋口质变小，故血对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA是很容易“缠”住大分子的东四的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作屮的去除，使最终获得的基因组DNA的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组DNA与蛋白质询护在一起，在纯化的过程屮有两种可能：如果DNA的特性占优势，则

6、纯化时以DNA的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋口质的特性占优势，则纯化时以蛋口质的形式被去除，导致DNA的损失。另外，象有些样品，如肌肉，即使是RNA抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液，原因在于这些样品屮的蛋白质，是非常难以去除的。高浓度蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl等）的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA相连接的蛋白质的裂解以及与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速

7、抑制住细胞内的RNA酶，从血确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品■主要是植物，其它绝大部分样品的RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞DNA抽提方而有优势，尤其是半得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作,但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无DNA污染的特点。控制好裂解液/菌体的比

8、例和操作的温和是该方法成功的关键。该方法不一定要使用PC纯化，但结合PC纯化，可以获得纯度很高的质粒。PCR模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不