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《SN-T 2708-2010 猪圆环病毒病检疫技术规范》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!#%#猪圆环病毒病检疫技术规范$%&'&()*(+,'-)-.-/0-',-'.*(+.*'.-1*'%23*2+&2+!#%#4%%4#%发布!#%%4#&4#%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖/犜2708—2010前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管
2、理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、广东省农业科学院兽医研究所。本标准主要起草人:朱道中、刘中勇、刘俊平、宋长绪、蒋智勇、陶琦、陈茹、林志雄。Ⅰ犛犖/犜2708—2010猪圆环病毒病检疫技术规范1范围本标准规定了猪圆环病毒病的病毒分离、鉴定和疫病诊断等方法的技术要求。本标准适用于猪圆环病毒病的监测、检疫、诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用
3、水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数CPE:细胞病变效应DNA:脱氧核糖核酸FITC:异硫氰酸荧光黄IFA:间接免疫荧光试验MEM:最低要求培养基Marker:分子量标记物nPCR:巢式聚合酶链式反应PCV1:猪圆环病毒1型PCV2:猪圆环病毒2型PK15:猪肾传代细胞系PBS:磷酸盐缓冲液RealtimePCR:荧光聚合酶链式反应SDS:十二烷基磺酸钠犜犪狇酶:犜犪狇DNA聚合酶4检疫方法4.1病毒的分离与鉴定4.1.1器材48孔或96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机
4、及离心管、组织研磨器、0.2的微孔滤膜、普通光学显微镜。μm1犛犖/犜2708—20104.1.2试剂44/mL)溶液。MEM培养液、胎牛血清、D氨基葡萄糖、青霉素(10IU/mL)和链霉素(10μg4.1.3犘犆犞2易感细胞PK15细胞。4.1.4犘犅犛见附录A。4.1.5病料采集无菌采集病死猪的腹股沟淋巴结、脾、肺、肾等组织样品或病猪的抗凝血,4℃保存,立即送检。若不能立即送检,应置-20℃以下条件保存备检。4.1.6病毒分离将采集的组织样品用PBS按1∶10的比例进行稀释,研磨成匀浆,或取病猪的抗凝血,反复冻融3次后,4500犵离心15min,取上清液,经微孔滤膜过滤除菌,接种在无
5、PCV感染的正常PK15细胞单层上,感作1h,倾尽接种液,加入含2%胎牛血清的MEM培养液(含100IU/mL的青霉素和100/mLμg的链霉素),37℃继续培养24h,弃上清液,加入300mmol/L的D氨基葡萄糖0.5mL,作用30min,倾去,PBS洗涤,再加入含2%胎牛血清的MEM培养液(含100IU/mL的青霉素和100/mL的链霉μg素),继续培养24h~48h。4.1.7病毒鉴定PCV2感染PK15细胞后不产生明显的细胞病变效应,故需采用IFA(见4.2)或nPCR(见4.3)等方法做进一步的鉴定。4.2间接免疫荧光试验(犐犉犃)4.2.1器材IFA诊断板、荧光显微镜、恒
6、温箱、保湿盒、微量移液器等。4.2.2试剂PCV2单克隆抗体、FITC结合物、0.25%胰蛋白酶、丙酮。
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