bio-rad双向电泳培训(正式资料)

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1、双向电泳实验流程l样品制备（Samplepreparation）l固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）l第一向等电聚焦（IEF）l胶条的平衡（IPGstripequilibration）l第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGEelectrophresis）l凝胶的染色及检测（Detection/Staining）lPDQuest软件分析（Softwareanalysis）l质谱鉴定（Proteinidentification）24目　　录第一章　　双向电泳1.1溶液配制1.2操作

2、步骤1.3注意事项第二章　　订货信息附录1双向电泳完整的操作步骤附录2　　聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3　　细胞样品的一般处理步骤附录4　　组织样品的一般处理步骤24第一章双向电泳1.1溶液配制水化上样缓冲液（I）尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。水化上样缓冲液（II）尿素7M4.2g硫脲2

3、M1.52gCHAPS4%0.4gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。水化上样缓冲液（III）尿素5M3.0g硫脲2M1.52gCHAPS2%0.2gSB3-102%0.2gDTT65mM0.098g（现加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml（40%）（现加）溴酚蓝0.001%10ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml分装

4、成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。24胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375MpH8.825ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）甘油20%20mlMilliQ水定容至100ml分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀，用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g充分混匀，用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸19

5、2mM1.44gSDS0.1%1ml（10%SDS）溴酚蓝0.001%100ml（1%溴酚蓝）MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清，室温保存。30%聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。1.5mol/LTris碱pH8.824Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。10%SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10%ApAp0.

6、1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4℃冰箱保存。10×电泳缓冲液（1×=25mMTris，192mMglycine，0.1%SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。1.2操作步骤（一）第一向等电聚焦（用自制溶液）1.从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。2.在小管中加入0.01gDTT，Bio-Lyte按照如下表格1ml的量加，充分混匀。IPGpHRangeB

7、io-LyteAmpholyte(Stock)RangeConc.(w/v)SampleSolutionVolumePer1mlper5mlper50ml3-103-1040%5ul25ul250ul4-74-640%2.5ul12.5ul125ul5-740%2.5ul12.5ul125ul3-63-520%5ul25ul250ul4-640%2.5ul12.5ul125ul5-85-840%5ul25ul250ul7-107-940%2.5ul12.5ul125ul8-1020%5ul25ul250ul2

8、43.从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于4:1。具体的上样体积如下表，ReadyStripTMIPG胶条的长度上样体积7cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul18cm315ul-630ul24cm410ul-820ul其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表，IPG胶条的