茎直黄芪中苦马豆素的提取工艺研究

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1、茎直黄芪中苦马豆素的提取工艺研究摘要：以茎直黄芪（Astragalusstrictus）为原料，通过单因素试验、正交试验和方差分析确定了苦马豆素的酶法提取工艺条件，并用气相色谱法测定了提取物中苦马豆素的含量。结果表明，优化后的茎直黄芪中苦马豆素最佳提取条件为，粉碎目数80目、料液比1∶40、纤维素酶添加量3.5%、酶解时间3.0h。在此提取条件下，苦马豆素的提取率可达到39.41mg/kg。该法快速、高效、方便、节能，有利于茎直黄芪中苦马豆素的提取。关键词：茎直黄芪（Astragalusstrictus）；苦马豆素；纤维素酶；气相色谱法中图分类号：S567.7文献标识码：A文章编号：043

2、9-8114（2013）08-1886-03茎直黄芪（Astragalus第7页共7页strictus）为豆科黄芪属多年生植物，在西藏各地均有分布，每年在其密集生长的牧区都有大批的家畜中毒死亡，是中国西藏牧区危害最严重的毒草之一[1，2]。茎直黄芪中的主要有毒成分为苦马豆素，是一种大极性的吲哚里西丁类生物碱，水溶性极好，经动物肠道吸收后，在溶酶体酸性环境下解离，因其阳离子结构与Α-甘露糖阳离子结构近似，使得竞争结合Α-甘露糖甘酶，不仅抑制了Α-甘露糖甘酶酶活性，同时造成溶酶体内甘露糖不能代谢而蓄积，导致细胞特别是神经细胞的空泡性，从而引起动物中毒[3]。苦马豆素同时还具有抗肿瘤活性，能特异

3、性地抑制高尔基氏体Α-甘露糖甘酶Ⅱ的活性，同时抑制了肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，从而抑制肿瘤的生长和转移，并能缓解化疗和放疗中产生的骨髓抑制作用[4]。目前苦马豆素的提取主要采用热回流法、索氏提取法、超声波提取的常规醇提法[5]。近年来，酶的用途越来越广泛，涉及的领域也越来越多，生物酶解提取法是利用酶反应的高度专一性，将细胞壁的水解或者降解，破坏细胞壁，从而提高有效成分的提取率。目前，中药提取方面研究较多的酶是纤维素酶[6，7]，大部分中药材的细胞壁主要是由纤维素类物质构成的，植物的有效成分往往包裹在细胞内部，用纤维素酶酶解可以使植物细胞壁破坏，有利于有效成分的提取。由于酶制剂在常温、常压条

4、件下就能起催化作用，能有效地提高植物药中有效成分的含量。目前关于酶解法提取苦马豆素鲜有报道。本试验为了进一步提高苦马豆素的提取率、降低生产成本，采用纤维素酶对茎直黄芪进行酶解提取苦马豆素，取得了良好的效果，为酶法提取苦马豆素提供了理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1材料与试剂第7页共7页茎直黄芪（西藏自治区农牧科学院提供）；苦马豆素标准品（购自西安杨凌天力生物技术有限公司，纯度为98.4%）；双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（硅烷化试剂，百灵威公司产品）；纤维素酶（工业级，140万活性单位）；甲醇、氯仿、正丁醇、吡啶、D-甘露醇等均为分析纯。1.1

5、.2仪器气相色谱仪（VARIANCP-3380）；色谱柱为瓦里安毛细色谱柱CP-SIL5CB（15M×0.25mm×0.33mm）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.2方法1.2.1样品处理将茎直黄芪自然条件下户外晾干，粉碎后过40～80目筛，备用。精密称取适量茎直黄芪干草粉于烧瓶中，加入一定量pH4.5的酸水，添加一定量的纤维素酶，在50℃下进行酶解反应。反应后将提取液煮沸2min，过滤，滤液浓缩成浸膏，甲醇溶解，过滤，滤液浓缩成浸膏，用碱性正丁醇溶解浸膏，过滤，回收正丁醇，并用吡啶溶解残留物作为供试样品，

6、准确量取吡啶溶液上清液100μL，分别加入10μLD-甘露醇标准品溶液和100μLBSTFA+TMCS（99∶1），室温条件下干燥器中衍生反应1h。进行GC分析，记录色谱峰面积比较分析。每组试验重复3次，取平均值。1.2.2色谱条件进样口温度为260℃，火焰离子化检测器（FID）温度为260℃，柱子初始温度为150℃，程序升温5℃/min（8min），再程序升温30℃/min（2min），气为高纯氮气，流速为1mL/min，定量方法为内标工作曲线法。1.2.3标准溶液的配置准确称取D-甘露醇2mg，溶于10mL吡啶中，配成质量浓度为0.2g/L的溶液。准确称取1第7页共7页mg苦马豆素标准

7、品，用吡啶配成质量浓度为0.1g/L的标准溶液，并将其分别稀释为0.05g/L、0.025g/L、0.0125g/L、0.00625g/L、0.003125g/L和0.0015625g/L的标准溶液。准确量取标准溶液100μL，分别加入10μL内标溶液和100μLBSTFA+TMCS（体积比为99∶1），供GC分析，绘制标准曲线。1.2.4标准曲线的绘制以标准样品中苦马豆素的峰面积和内标峰面积之比为纵坐标，以苦马豆素的质