现代生化药学课后题答案

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1、第一章PCR1PCR的英文全称是什么?PolymeraseChainReaction2PCR是谁发明的？KaryMullis3PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。4PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（

2、2n），后者以几何级数增加（2n）。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。5一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种基本成分:模板,特异性引物,热稳定DNA聚合酶,脱氧核苷三磷酸(dNTP),二价阳离子,缓冲液及一价阳离子,石蜡油(可忽略)模板：待扩增的DNA或RNA,甚至细胞；引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5’端决定了扩增产物的5’端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、

3、位置和结果。DNA聚合酶：a.聚合作用，将dNTP中脱氧单核苷酸逐个加到3’-OH末端,b.3’-5’外切酶活性，校正功能,c.5’-3’外切酶活性，切除错配核苷酸；石蜡油：维持恒热和整个体系中盐浓度，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。6PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。PCR反应对模板纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品即可以作为模板；但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白；虽然片段长短不是

4、影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、μg级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。7什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的5’末端位置。(引物要大大过量)特异性引物：引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。简并性引物：简并引物是

5、指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。8引物设计的基本原则有哪些？a.引物长度一般在20～24bp(≥16,≤30)：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b.（G+C）%含量：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列时应与模板的相近。40%-60%c.引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；d.两引物间不可发生互补(特别是3’端，若不可避免那3’端互补碱基不可超过2个碱基)；e.引物3’端配对：引物3’端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此该端5-6个碱基与DNA的配对

6、必须严格、准确。9PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a.Klenow片段：为DNA聚合酶Ⅰ的片段，有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性(最适37℃)；b.Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受93～95摄氏度(最适74-75℃)，是PCR普及的关键。它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能，点突变较多。依赖Mg2+。c.Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，去除Taq酶的5’~3’外切酶活性，将97.5摄氏

7、度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；d.VentTMDNA多聚酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能(3’~5’外切酶活性)。e.RTth逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。10PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？1）dNTP应具有一定浓度：50-200μmol/L,不得低于10-15。浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入；高浓度dNTPs易产生错误掺入，而