紫外可见分光光度计的结构、工作原理与应用

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1、紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计原理是：分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。根据Lambert-Beer定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。你可以用紫外可见分光光度计测定定三种农药的波长在某溶液中的最大、最小吸收波长。配制溶液－在光谱检测项下进行－调整检测光谱范围及速度－－扫描光

2、谱图－－吸光度最大处对应波长为最大吸收波长，吸光度最小处对应的波长为最小吸收波长。1.光源灯;2.滤光片;3.球面反射镜;4.入射狭缝;5.保护玻璃;6.平面反射镜;7.准直镜;8.光栅;9.保护玻璃;10.出射狭缝;11.聚光镜;12.试样室;13.光门;14.光电管.分光光度计工作原理:由光源灯(1)发出连续辐射光线,经滤光片(2)和球面反射镜(3)至单色器的入射狭缝(4)聚焦成像,光束通过入射狭缝(4)经平面反射镜(6)到准直镜(7)产生平行光,射至光栅(8)上色散后又以准直镜(7)聚焦在出

3、射狭缝(10)上形成一连续光谱,由出射狭缝选择射出一定波长的单色光,经聚光镜(11)聚光后,通过试样室(12)中的测试溶液部分吸收后,光经光门(13)再照射到光电管(14)上.调整仪器,使透光度为100%,再移动试样架拉手,使同一单色光通过测试溶液后照射到光电管上.如果被测样品有光吸收现象,光量减弱放大器处理,将光能的变化程度通过数字显示器显示出来.可根据需要直接在数字显示器上读取透光度(T),吸光度(A)或浓度(C).基本操作:(1)通电---仪器自检----预热20min;(2)用键设置测试方

4、式:透射比(T),吸光度(A),已知标样浓度方式(C)和已知标样浓度斜率(K)方式;(3)波长选择:用波长调节旋钮设置所需的单色光波长;(4)放样顺序:打开样品室盖,在1~4号放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑体),参比液,样品液1和样品液2.(5)校具(黑体)校"0.000":将%T校具(黑体)置入光路,在T方式下按"%T"键,此时仪器自动校正后显示"0.000"(6)参比液校"100"%T或"0.000"A:将参比液拉入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时仪器显示"BLA

5、",表示仪器正在自动校正,校正完毕后显示"100"%T或"0.000"A后,表示校正完毕,可以进行样品测定.(7)样品测定:将两样品液分别拉入光路中,此时若在"T"方式下则可依次显示样品的透射比(透光度)若在"A"方式下,则显示测得的样品吸光度.7200型光栅分光光度计的使用注意事项(1)(1)预热是保证仪器准确稳定的重要步骤.(2)比色皿的清洁程度,直接影响实验结果.因此,特别要将比色皿清洗干净.先用自来水将用过的比色皿反复冲洗,然后用蒸馏水淋洗,倒立于滤纸片上,待干后再收回比色皿盒中.必要时,

6、还要对比色皿进行更精细的处理,如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡,冲洗.(3)比色皿与分光光度计应配套使用,否则会引起较大的实验误差.比色皿不能单个调换1.37200型光栅分光光度计的使用注意事项(2)(4)比色皿内盛液应为其容量的2/3,过少会影响实验结果,过多易在测量过程中外溢,污染仪器.比色皿中试样装入量应为2/3～3/4之间(5)拿放比色皿时,应持其"毛面",杜绝接触光路通过的"光面".如比色皿外表面有液体,应用绸布拭干,以保证光路通过时不受影响.(6)若待测液浓度过大,应选用短光径的比色皿,一般应

7、使吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜.由于测定空白,标准和待测溶液时使用同样光径的比色皿,故不必考虑因光径变化而引起的影响.UV-754型紫外-可见分光光度计正确使用方法2.1紫外分光光度计法概述(1)2.1.1定义用紫外光源通过分光光度技术对物质进行测定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的仪器叫作紫外分光光度计.2.1.2原理因为许多化合物的分子结构中存在共轭双键,在200～400nm的紫外光区具有吸收光的特性,所以无需进行显色反应便能直接测定.2.1.3应用常用于对蛋白质和核酸进行定性,定量

8、测定.蛋白质分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基在波长280nm处具有最大吸收峰.故常用波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度.2.1.4特点(1)组成核酸的碱基也含有共轭双键,其最大吸收峰的波长在260nm处.但在280nm处也有一定的光吸收,对蛋白质的测定有一定的干扰作用.若分别测定280nm和260nm处的吸光度,可通过经验公式消除核酸对蛋白质测定的影响.(2)可对微量蛋白质(1～10g/L)不需显色,进行直接定量测定.因此操作简便,而且可回收样品.此外,盐