GB15193.5-2014食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验.pdf

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1、中华人民共和国国家标准犌犅１５１９３．５—２０１４食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验２０１４１２２４发布２０１５０５０１实施中华人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会犌犅１５１９３．５—２０１４前言本标准代替ＧＢ１５１９３．５—２００３《骨髓细胞微核试验》。本标准与ＧＢ１５１９３．５—２００３相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验”；———修改了范围；———增加了术语和定义；———增加了试验报告；———增加了试验的解释；———修改了试验目的和原理；———修改了实验动物；———修改了给予程序；———修改了标本制作；———修改了阅片的内容。Ⅰ

2、犌犅１５１９３．５—２０１４食品安全国家标准哺乳动物红细胞微核试验１范围本标准规定了哺乳动物红细胞微核试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的遗传毒性作用。２术语和定义２．１微核细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍留在细胞质中的整条染色单体或染色体的无着丝断片或环。在末期单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成。２．２着丝粒在细胞分裂期染色体与纺锤体纤维连接的区域，以使子染色体有序移动到子细胞两极。２．３正染红细胞成熟的红细胞，其缺乏核糖体并可用选择性核糖体染料与未成熟的嗜多染红细胞区分。２．４嗜多染红细胞未成熟的红细胞处于发育的中间期，仍含

3、有核糖体，故可用选择性核糖体染料与成熟的正染红细胞区分。２．５总红细胞正染红细胞和嗜多染红细胞的总和。３试验目的和原理哺乳动物红细胞微核试验通过分析动物骨髓和（或）外周血红细胞，用于检测受试物引起的成熟红细胞染色体损伤或有丝分裂装置损伤，导致形成含有迟滞的染色体断片或整条染色体的微核。这种情况的出现通常是受到染色体断裂剂作用的结果。此外也可能在受到纺锤体毒物的作用时，主核未能形成代之以一组小核，此时小核比一般典型的微核稍大。４仪器和试剂４．１仪器解剖器械、生物显微镜、载玻片等。１犌犅１５１９３．５—２０１４４．２试剂注：全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。４．２．１小牛血清：小牛血

4、清滤菌后放入５６℃恒温水浴保温１ｈ进行灭活。通常储存于４℃冰箱里。亦可用大、小鼠血清代替。４．２．２Ｇｉｅｍｓａ染液：称取Ｇｉｅｍｓａ染料３．８ｇ，加入３７５ｍＬ甲醇研磨，待完全溶解后，再加入１２５ｍＬ甘油。置３７℃恒温箱保温４８ｈ，期间振摇数次，取出过滤，两周后可用。４．２．３Ｇｉｅｍｓａ应用液：取一份Ｇｉｅｍｓａ染液与６份磷酸盐缓冲液混合而成。现用现配。４．２．４１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）：磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）４．５０ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１１．８１ｇ加蒸馏水至１０００ｍＬ４．２．５甲醇。５试验方法５．１受试物５．１．１受试物的配制：应将受试物

5、溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。５．１．２给予途径：应采用灌胃法。阳性对照物也可采用腹腔注射的方法。灌胃体积一般不超过１０ｍＬ／ｋｇ体重，如为水溶液时，最大灌胃体积可达２０ｍＬ／ｋｇ体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过４ｍＬ／ｋｇ体重；各组灌胃体积一致。５．２实验动物５．２．１动物种、系选择：在利用骨髓时，推荐使用小鼠或大鼠。利用外周血时，推荐用小鼠。如果已经证实某品系动物脾脏不清除有微核的嗜多染红细胞，或

6、对引起染色体结构或数目畸变的化学物检测有足够的敏感性，则此种动物可以利用。通常用７周龄～１２周龄，体重２５ｇ～３５ｇ的小鼠或体重２００ｇ～３００ｇ的大鼠，在试验开始时，动物体重差异应不超过每种性别平均体重的±２０％。每组用两种性别的动物至少各５只。５．２．２动物准备：试验前动物在试验动物房应进行至少３ｄ～５ｄ环境适应和检疫观察。５．２．３动物饲养：实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定（ＧＢ１４９２５、ＧＢ５７４９、ＧＢ１４９２４．１、ＧＢ１４９２４．２、ＧＢ１４９２４．３）。每个受试物组动物按性别分笼饲养，每笼５只。试验期间实验动物喂饲基础饲料，自由饮水。５．３剂量受试物应

7、设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和（或）个别动物出现死亡的剂量，一般可取１／２ＬＤ５０，低剂量组应不表现出毒性，分别取１／４ＬＤ５０和１／８ＬＤ５０作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出ＬＤ５０时，高剂量组则按以下顺序：ａ）１０ｇ／ｋｇ体重；ｂ）人的可能摄入量的１００倍；ｃ）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶媒对照组