亲和柱层析操作规程(包涵体蛋白)

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1、亲和柱层析操作规程（包涵体蛋白）1.装柱：1.1取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02MPBbufferB缓冲液(PH8.0)平衡Ni柱，直至流出液的pH为8.0；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02MPBbufferB缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂

2、蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含5mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含5mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含10mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含20mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约

3、30ml，至流出液与含20mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含40mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含50mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含50mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mM咪唑的PBb

4、ufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2用含200mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的PBbu

5、fferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3用含500mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mM咪唑的PBbufferB缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的PBbufferB缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用

6、含500mM咪唑的缓冲液B（pH8.0）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。