包涵体变性亲和层析复性方法

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1、包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20mMTris-HCl,50mMNaCl,pH8.0洗涤液：20mMTris-HCl,10mMEDTA,3M尿素，pH8.0变性液：20mMTris-HCl,8M尿素，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH8.5洗脱液：20mMTris-HCl,8M尿素，500mM咪唑，pH8.5复性液：20mMTris-HCl,50mMNaCl,0.1ML-Arg,0.5mMGSH,0.05mMGSSG,5%甘油，1%PEG实验方法：1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解

2、液，高压破碎，12000rpm离心30min，沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5mlNi柱，用变性液平衡，用pH4.5的20mMNaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM,100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用

3、变性液调节其浓度至0.5mg/ml左右。再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6h，然后透析至含有2M尿素的复性液中，透析8h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h;最后透析至储存缓冲液(20mMTris-HCl.50mMNaCl,20%甘油,pH8.0)中。5000rpm离心10min,取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。