医学ppt--dna损伤修复与抗肿瘤药物研究

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冯冰虹教授DNA损伤修复与抗肿瘤药物研究 2基因突变（genemutation）:在生物进化过程中，由于生物体内外环境多种因素的影响，使遗传物质的结构改变而引起遗传信息的改变，均可称为突变。从分子水平来看，突变主要表现为DNA分子上碱基的改变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNAdamage）。 突变的意义3（一）突变是进化、分化的分子基础。（二）只有基因型改变，而无可察觉表型改变的突变（基因多态性：用于描述个体之间的基因型差别现象）。（三）致死性的突变（利用此特性消灭有害病原体）。（四）突变是某些疾病的发病基础。 4第一节DNA损伤的因素和类型 一、引起DNA损伤的因素5*紫外线照射*电离辐射自发突变：频率：10-9*5-溴尿嘧啶(5-BU)*羟胺*亚硝酸盐*氮芥类物理生物化学诱变因素病毒等 DNA损伤的后果信号传导异常长时辰效应老化肿瘤疾病DNA修复机制短期效应异常增生和代谢生理功能紊乱细胞死亡细胞增殖减少基因表达异常基因组不稳定6 （一）DNA的自发性损伤71、DNA的复制错误2、DNA的修复合成修复系统将DNA损伤部位的一段DNA切除，再以互补链为模板重新合成DNA，又称DNA非程序合成。3、碱基的自发突变脱氨基:A、G、C环外氨基丢失碱基丢失:无碱基位点(AP部位)4、正常代谢产物对DNA的损伤氧自由基造成DNA链断裂 （二）环境造成的DNA损伤81、紫外线引起的DNA损伤UVTGAACCACTTGG胸腺嘧啶二聚体DNA之间交联DNA与蛋白质交联DNA链断裂 92、电离辐射引起DNA损伤（1）导致碱基变化主要由·OH自由基引起，包括DNA链上碱基氧化修饰、过氧化物形成、碱基环的破坏和脱落等。（2）导致脱氧核糖变化脱氧核糖上每个碳原子和羟基上氢都能与·OH反应,导致脱氧核糖分解，最终引起DNA链断裂（3）导致DNA链断裂可使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂。有单链断裂、双链断裂等不同形式。（4）引起DNA链交联DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联。是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础 103、烷化剂引起DNA损伤（1）导致碱基烷基化G的N7和A的N3最容易烷基化，G的N7被烷基化后改与T配对，G-C→A-T（2）导致碱基脱落G烷基化后的糖苷键不稳定，易脱落形成DNA上无碱基位点，复制时可插入任何核苷酸，使序列改变。（3）导致DNA链断裂磷酸二酯键上的O易烷基化，形成不稳定的磷酸三酯键，糖与磷酸间发生水解，DNA链断裂。（4）引起DNA链交联单功能基烷化剂：甲基甲烷碘酸双功能基烷化剂：DNA链内、链间、以及与蛋白质的交联氮芥、硫芥；环磷酰胺；二乙基亚硝酸 114、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变（1）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）。（2）某些化学物质能专一修饰DNA链上碱基亚硝酸盐：使C脱氨变成U，经复制使G-C→A-T羟胺：使T脱甲基变成C，结果A-T→G-C黄曲霉素B：专一攻击DNA上碱基，导致序列变化这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂 二、DNA损伤的类型12单点突变、多点突变转换、颠换链内共价交联链间共价交联电离辐射、某些化学试剂使链内磷酸二酯键断裂DNA重组DNA损伤碱基突变DNA链断裂DNA链交联插入或缺失单个碱基、多个碱基、一段序列的插入或缺失DNA分子内发生较大片段的交换。 1.碱基和糖基破坏●损伤因素酸、热去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基、活性氧、紫外线●损伤类型碱基丢失/插入、碱基置换、DNA片段缺失/插入13 2.错配●损伤因素碱基类似物、碱基修饰剂、自发脱氨基●常见错配类型U→T14 3.DNA链断裂●损伤因素电离辐射、化学物质诱导●损伤类型单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能原位修复，易致畸)15 4.DNA交联化学物质诱导(如丝裂霉素)●损伤因素●损伤类型链内交联同一DNA链上碱基共价结合嘧啶二聚体DNA链上相邻的两个嘧啶碱基之间共价结合，形式有TT、CT、CC链间交联不同DNA链之间的碱基共价结合DNA-蛋白质交联DNA与蛋白质以共价键结合16 DNA交联示意图17 第二节DNA损伤的修复的机制18 常见的DNA损伤及其修复机制DNA损伤因素DNA损伤类型修复机制X射线、氧自由基、烷化剂自发脱碱基单链断裂、无碱基位点、氧化性碱基（如8-氧鸟嘌呤）脲嘧啶碱基切除修复紫外线和多环芳烃环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线光产物和稳定的多环芳烃化合物等大分子DNA加合物核苷酸切除修复抗癌药（如顺铂和丝裂霉素）双链断裂和链间交联双链断裂修复（同源重组修复和末端连接）复制错误和烷化剂碱基错配和缺失（插入）错配修复19 修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。光修复(lightrepairing)切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)SOS修复错配修复修复的主要类型一、DNA损伤的修复的概念和类型20 二、DNA损伤的修复的机制光复活酶与DNA链上嘧啶二聚体部位结合↓受波长为260-380nm的近紫外线作用激活使二聚体解聚↓酶从DNA链上解离，DNA恢复正常结构（一）回复修复●酶学光复活21 光修复酶(photolyase)UV22 23 ●嘌呤直接插入●O6-甲基鸟嘌呤-DNA的甲基转移●单链重接（单链断裂修复）24 2023/9/142525 （二）切除修复●定义在多种酶的作用下，先将损伤区域切除，然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱基顺序来修补●切除过程●切除方式碱基切除修复、核苷酸切除修复识别并切除→修复合成并连接26 2.1碱基切除修复（base-excisionrepair,BER）所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-β－糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。27 DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链→碱基切除修复(base-excisionrepair)。28 .糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-β-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。29 由AP磷酸内切酶将受损核甘酸的糖苷-磷酸键切开5‘3‘30 DNA连接酶连接利用DNA聚合酶I在切除损伤部位，补上核苷酸31 2023/9/143232 ●核苷酸切除被切除的不是单个碱基，而是一段寡核苷酸。是细胞内更为重要的一种修复方式●切除修复的特点是DNA修复的一种普遍形式33 2.2核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）是机体正常细胞针对DNA链上较大损伤的修复过程，它由多种DNA修复酶组成。34 2.2核苷酸切除修复（Nucleotideexcisionrepair,NER）损伤发生后，首先由DNA切割酶(excinuclease)在己损伤的核苷酸5’和3’位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12～13个核苷酸(原核生物)或27～29个核苷酸(人类或其他高等真核生物)的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶Ⅰ(原核)或ε（真核)合成新的片段，并由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。35 识别损伤部位损伤的两边切除几个核苷酸DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链DNA连接酶将切口补平36 （三）重组修复●定义重组酶系将未受损伤的DNA片段移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复●分类●同源性重组两段双链DNA同源性大于200bp，大肠杆菌及酵母中RecA蛋白、人细胞中Rad51是关键●非同源性重组同源性低，DNA双链断裂的主要修复方式，关键分子是DNA-PK及XRCC4，非精确修复37 2023/9/143838 复制中出现损伤重组修复DNA聚合酶填补缺损39 2023/9/144040 （四）错配修复（mismatchrepair，MMR）DNA错配修复是细胞复制后的一种修复机制,具有维持DNA复制保真度,控制基因变异的作用。错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基。但如何避免将DNA链上正确的碱基切除呢？这就需要将oldstrand和newstrand区分开来。41 原核生物利用甲基化区分oldstrand和newstrand，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复（methyl-directedmismatchrepair）。42 错配修复系统识别母链靠Dam甲基化酶（Dammethylase），它能使位于5’GATC序列中A的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化。刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来得及甲基化，而作为模板的oldstrand早已被甲基化了，利用这种差别区分oldstrand和newstrand。43 此后，一旦发现错配碱基，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链即将未甲基化的链切除，并以甲基化的链为模板进行修复合成。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化）。这一区别很重要44 错配修复（mismatchrepair）●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺苷酸甲基化●甲基化紧随在DNA复制之后进行●根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基通过3个蛋白质（MutS、MutH和MutL）校正45 根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图1.MutS发现错配碱基2.在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配点的DNA双链结合3.MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链46 甲基化指导的错配修复示意图错配碱基位于切口3’下游端，错配碱基位于切口5’上游端，47 （五）SOS修复●定义DNA损伤时应急产生的修复作用，解除修复系统抑制，使其产物(多种修复蛋白)参与修复48 SOS修复中LexA-RecA操纵子的作用机理49 当细菌DNA遭到破坏时，细菌细胞内会启动一个被称为SOS的诱导型DNA修复系统。在正常情况下，DNA损伤的修复基因的操纵子被LexA蛋白所阻遏。SOS修复系统受到LexA阻遏蛋白的抑制，平时该蛋白表达水平很低。SOS体系的诱导表达过程其实就是LexA阻遏蛋白从这个基因的上游调控区移开的过程。阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答50 当有紫外线照射时，细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。RecA蛋白：是SOS反应的最初的发动因子。在单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活，表现出水解酶活性，分解LexA阻遏物。51 表达RecA蛋白与这些缺口处单链DNA相结合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的RecA蛋白将LexA蛋白切割成没有阻遏作用的和具有与操纵区DNA结合活性的两个片段，导致SOS体系的高效表达，使DNA得以修复。52 SOS反应SOS基因紫外线激活RecALexA阻遏蛋白与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质基因表达LexA阻遏蛋白操纵序列DNA53 当修复完成后，活化信号消失，RecA蛋白回复到非蛋白水解酶的形式，LexA蛋白开始逐步积累，并重新建立起阻遏。RecA蛋白的合成停止，DNA恢复复制，RecA蛋白被稀释到原来的本底水平。54 三、DNA修复的细胞周期检查点控制真核生物细胞DNA受到损伤时细胞除了诱导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防止受损DNA继续复制，如无法修复，则可诱导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查点控制（checkpointcontrol，又称关卡控制）对DNA损伤的应答反应。55 酵母细胞的细胞周期检查点控制机制DNA损伤在S期DNA损伤在G1和G2期G1SG2MPOL2RFC5DPB11RAD9RAD17RAD24MEC3MEC1,TEL1RAD5356 哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制DNA损伤P21Gadd45BaxP53CDK/cyclinGadd45Gadd45-PCNABlockingcellcycleExcisionrepairingCellapoptosis57 四、DNA损伤应答的研究进展（一）乙酰转移酶Tip60在DNA损伤应答中作用的研究进展Tip60(Tat—interactiveprotein)是进化上极为保守的乙酰转移酶，它在细胞周期阻滞、凋亡、DNA损伤修复等众多生理学过程中都发挥着重要的作用。作为许多转录因子的共调节因子，Tip60既可以激活也可以抑制特定基因的转录。当发生DNA损伤时，它被招募到损伤位点，参与DNA损伤应答的感受、信号转导和修复过程中。除此之外，Tip60还与许多病理过程有关，尤其是在肿瘤发生中起着关键作用。58 Tip60可以p53依赖和不依赖两种方式参与DNA损伤应答：59 （二）调控DNA损伤修复基因的miRNA60 61 62 第三节DNA损伤和修复的基因63 一、甲基化损伤修复相关基因甲基转移酶（MGMT）把O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上，修复甲基化的DNA。MGMT突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。64 二、切除修复相关的酶和基因尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，可作为DNA损伤的生物标记物。大肠杆菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修复基因等65 三、错配修复相关基因MSH2、MLH1等蛋白参与错配修复，而错配修复的缺陷往往是癌变的第一步。错配修复基因：Muthls系统、人类的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。错配修复基因的微卫星序列的不稳定性（microsatelliteinstability，MI）66 四、DNA聚合酶βDNA聚合酶β参与辐射损伤和化学损伤的修复，并对细胞的生长具有调节作用。DNA聚合酶β的突变可导致碱基切除修复功能的缺陷。67 五、DNA加合物英文名称：DNAadduct定义：DNA分子与化学诱变剂间反应形成的一种共价结合的产物。这种结合激活了DNA的修复过程。如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核苷酸的替代、缺失和染色体的重排。DNA加合物可作为DNA损伤的暴露标记物和效应标记物，其去除的速度也可作为DNA修复功能的生物标记物。68 DNA损伤和修复的生物学意义避免基因组的不稳定性、癌症和细胞死亡是至关重要的。DNA修复途径可以识别和修复特异的DNA损伤，保证生物物种的遗传稳定性。69 第四节与DNA修复有关的人类遗传疾病着色性干皮病(Xerodermapigmentosum)布伦氏症候群(Bloom’ssyndrome)遗传性大肠癌(Hereditarynonpolyposiscoloncancer；HNPCC)70 71 着色性干皮病(Xerodermapigmentosum)是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶异常造成DNA修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。1.幼年发病，常有家族发病史。2.面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片，伴毛细血管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶性黑素瘤。3.皮肤和眼对日光敏感。4.病情随年龄逐渐加重，多数患者于20岁前因恶性肿瘤而死亡。5.组织病理晚期出现表皮非典型性增生、日光角化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。72 着色性干皮病患儿脸部特征73 着色性干皮病背部,着色性干皮病组织切片74 着色性干皮病的并发症75 着色性干皮病的治疗避免紫外线照射避免肿瘤致病因子对症治疗76 遗传性大肠癌的临床特征发病早(~45岁)肿瘤好发部位肠外肿瘤的类型77 遗传性大肠癌(HNPCC)息肉较少30-60%有内膜肿瘤恶性肿瘤好发部位胰腺癌发生率78 大肠癌发生的危险因素(CRC)020406080100GeneralpopulationPersonalhistoryofcolorectalneoplasiaInflammatoryboweldiseaseHNPCCmutationFAP5%15%–20%15%–40%70%–80%>95%Lifetimerisk(%)79 错配基因的改变多发性家族性结肠癌80 多发性家族性结肠癌错配基因的改变:MSH2,MSH6,PMS1，MLH1,MSH3,PMS2.81 HNPCC中错配基因突变的概率MSH2~30%MLH1~30%PMS1(rare)PMS2(rare)MSH6(rare)Unknown~30%SporadicFamilialHNPCCFAPRareCRCsyndromesLiuBetal.NatMed2:169,199682 HNPCC发生的危险因素基因携带者发生的危险因素:早期:20-25岁妇女:年龄(?)25-35岁HNPCC家族成员之一发生的概率:胃癌发生:早期发生年龄3-35岁,复发1-2年尿道肿瘤发生:30-35岁,复发1-2年NCCNpracticeguidelinesinoncology–v.1.200383 第五节肿瘤的预防及抗肿瘤药物略84