gbt 27640-2011 马痘诊断技术

《gbt 27640-2011 马痘诊断技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11．220B41a国中华人民共和国国家标准GB／T27640—2011马痘诊断技术Diagnostictechniquesforhorsepoxdisease2011-12-30发布2012—04—01实施1范围马痘诊断技术本标准规定了马痘临床诊断、病毒分离与鉴定等诊断技术要求。本标准适用于马痘的诊断。2临床检查GB／T27640--20112．1临床特征病马于系部和球节处的皮肤上出现丘疹，随后变为水疱，最后为脓疱，并干涸而结痂。由于局部疼痛，可引起跛行，病马一般不显全身症状；有的病马于唇内侧、齿龈

2、、舌、舌系带、颊部等粘膜上发生痘疹，也是先发丘疹，继而水疱和脓疱，脓疱破裂形成浅的溃疡；母畜外生殖器水肿，并在皮肤和粘膜上形成水疱、脓疱和溃疡，公畜的病变表现为阴茎、包皮和龟头上的痘疹样病变。2．2初步判定2．2．1根据临床特征可作出病马感染马痘的初步判定。2．2．2最终判定应进行病毒分离鉴定。3病毒分离3．1样品采集和运送要求采取病变部位的渗出液、水疱液和溃疡部位组织作为采集对象，尽量无菌采集，采集后低温送实验室进行病毒分离。3．2病毒分离试验3．2．1所需仪器、设备3．2．1．1CO。培养箱。3．2．1

3、．2Ⅱ级生物安全柜。3．2．1．3倒置显微镜。3．2．1．4带冷冻功能的离心机。3．2．2材料准备3．2．2．1细胞培养基DMEM。3．2．2．2Hela细胞。3．2．2．3Hanks液(Hanks液，见A．1；含抗生素，见A．4)。3．2．2．4小牛血清。3．2．2．5待检马组织：采取病变部渗出液、水疱液或丘疹和溃疡部组织作为标本，用Hanks液配制成1：10悬液，以1500r／rain离心10min，取上清备用。1GB／T27640--20113．2．2．6接种方法：用含lO％d,牛血清的DMEM培养液

4、培养Hela细胞，待细胞长成单层后弃去培养液。将3．2．2．5中的待检组织接种Hela细胞，然后加入含5％小牛血清的DMEM培养液。CO：培养箱内37℃，48h后观察细胞病变。3．3判定如果48h后出现明显的细胞病变，如细胞圆缩、聚集，可进一步做病毒鉴定。正常的Hela细胞为多角形，贴壁生长。4电子显微镜检查4．1材料准备4．1．1戊二醛，碳网膜，三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸(Tris—EDTA)，磷钨酸(pH7．2)，滤纸，载玻片。4．1．2病毒液或待检病料，如病变部位的渗出液或水疱液。4．2负染操作方

5、法4．2．1用戊二醛固定待检病料。4．2．2负染方法为：取一滴待检病料于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上1min，再置于一滴三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸(Tris—EDTA)缓冲液中浸泡20S，然后用一滴1％的磷钨酸(pH7．2)染色lOS。取出碳网膜，用滤纸吸干膜上液体，待自然干燥后镜检。4．3判定电镜下见到砖形或大卵圆形，有一个双凹面的核心体，同时具有包膜。观察到上述结果，可判定为马痘感染。5分子生物学检测5．1材料准备5．1．1待检样品材料分离的病毒、病毒感染的细胞或所采集的病料，如病变部位的渗出液或

6、水疱液。5．1．2仪器设备PCR仪，恒温水浴锅，电泳仪，冷冻离心机，凝胶成像系统或其他类似设备(观察电泳结果)，微波炉或相关仪器(琼脂糖凝胶的制备)，超声波破碎仪，一20℃冰箱。5．1．3试剂o．25％胰蛋白酶溶液(见A．2)，RNase，70％乙醇，TaqDNA聚合酶，PBS缓冲液，酚三氯甲烷，引物，dNTPs，去离子水，加样缓冲液，电泳缓冲液，溴化乙锭溶液(见B．3)或相关染料(现在已经有溴化乙锭的替代产品，而且无致癌性，如GelRed)。缓冲液的配方见附录B。5．2病毒基因组DNA的制备用0．25％的

7、胰酶消化感染病毒的Hela细胞，3000r／rain离心5min，收集的细胞沉淀用PBS缓冲2GB／T27640--2011液重悬，于95℃水浴灭活30min。重复离心，收集沉淀。再用2mLPBS缓冲液重悬细胞。将细胞至于冰浴，超声波粉碎，输出功率为40w，时间3min，每5S暂停5S。细胞经破碎后加人10pLRNase，37℃反应30min。待溶液温度降至室温后，加入400pL酚三氯甲烷，混匀后于冰浴中放置5min，然后13000r／rain离心5min，收集DNA沉淀。用70％乙醇洗沉淀一次。空气干燥沉

8、淀，加入i00pL去离子水溶解DNA，分装保存于一20℃冰箱中备用。本步骤也可采取相关商品化的病毒DNA提取试剂盒。采集的病料可采取同样的方法或用商品化试剂盒进行病毒DNA的提取。5．3痘苗病毒血细胞凝集素HA(Hemagglutinin，HA)基因的PCR扩增5．3．1引物序列上游引物：5’一ATGACACGATTGCCAATAC-3’；下游引物：5’-CTAGACTTTGTTTTCTG-3’。5．3．2各反应