最新分子生物学实验技术幻灯片.ppt

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1、分子生物学实验技术RT-PCR原理及应用提取总RNA反转录cDNAPCR作模板获得目的基因应用：基因检测、基因转录产物的分析、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统一、RNA的提取RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。二、cDNA的合成反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶种类：两种1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶包括两个多肽亚基（最适温度42℃）活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成

2、以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。2、鼠白血病病毒(MLV)反转录酶只有单个多肽亚基（最适温度37℃）活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。cDNA引物种类：1、随机六聚体引物：不特异的引物体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rR

3、NA。2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3、特异性引物用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。第二章聚合酶链式反应（PCR）一、PCR基本步骤三个步骤：1、变性(Denature)：双链DN

4、A目的片段在94℃下解链。2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。3、延伸(Extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。二、PCR反应中的主要成分引物：好坏是PCR成败的关键。设计原则：1、引物长度约为16-30bp2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因

5、这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。4、引物3‘-端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构，且3’-端尽量不用T，尤应避免连续2个或2个以上T，因为T引发错配的几率高。6、两引物之间尤其在3‘-端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在5'

6、-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。引物浓度：一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。Mg2

7、+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。模板：PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状

8、分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝基因，需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用量更少。模板过多可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40mi