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时间:2021-04-24
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1、b第六章植物基因工程下剖析第六章植物基因工程(下)三、改进转基因的技术转基因植物中外源基因的沉默提高外源基因表达水平的策略四、农作物基因工程五、生物反应器六、转基因植物的安全性三、改进转基因的技术3.重复序列诱发基因沉默通过电击法等将DNA直接导入植株,外源基因往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内。重复序列诱发的基因沉默(repeatinducedgenesilencing,RIGS)与重复序列间的异位配对和DNA的甲基化相关。一般一个位点插入的外源基因的拷贝数越多,失活的程度越高。3.重复序列诱发基因沉默解决方案有:对外源基因
2、及启动子进行改造,保证设计的序列与植物基因组有很短的同源序列,避免异位配对的发生;使用基因枪法及电击法等直接DNA导入法容易引起多拷贝基因的插入,而使用农杆菌转化法可在一定的程度上避免多拷贝基因的插入;在筛选作为育种材料的转基因植物时,尽量选择单拷贝插入的个体,采用RT-PCR法可以筛选到单拷贝插入的个体。4.共抑制共抑制是一种基因间相互作用引起的沉默现象。当引入一个与植物内源基因有部分同源性的DNA时,不但外源基因不能高效表达,反而抑制了内源基因的表达。二、提高外源基因表达水平的策略1.转化方法的影响基因直接转化法容易引起多拷贝转基
3、因在寄主细胞中的整合,导致转基因沉默,而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少,可以在一定的程度上避免这个问题。2.使用信号肽植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。为提高转基因在植物的专门组织中的表达,除使用专门的启动子外,使用特定的信号肽序列是必需的。3.选择强启动子和诱导型启动子选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手段。通常来源于双子叶植物的启动子,在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多,反之亦然。有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达,而要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表
4、达。这就需要使用诱导型启动子,其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达。4.强终止子在植物转化的研究中,两个常用的终止子是CaMV35S启动子和根瘤土壤杆菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。其PolyA尾巴和其中的茎-环结构,可有效地抵御核酸酶的水解作用,使mRNA分子保持稳定性。5.消除甲基化的影响已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。人们还试图在载体上加上去甲基化功能的序列来防止甲基化。6.使用植物偏爱的密码子转基因的密码子和植物基因组DNA的不同容易引起甲基化和表达效率
5、低。在遗传转化前有必要优化转基因的密码子,尽量使用一些植物偏爱的密码子。7.使用MAR序列基质结合区(matrixattachmentregion,MAR)也叫核骨架结合区(scaffoldattachmentregion,SAR)长度一般为300-1000bp,它可以与核骨架结合,在两个MAR间的染色质区域可形成DNA环,环的大小为5-200kb,每一个环为一个独立的表达结构。利用MAR的这一特性,可创造一个独立的结构域,减少了插入位点附近染色质的影响,从而可以避免位置效应的影响,还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。8
6、.使用增强子动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段的去甲基化,启动基因的转录。在植物中分离相应的增强子,并和外源基因重组,可确保转基因按合适的调控模式表达。9.外源基因的修饰和改造(1)避免基因间的同源性;(2)避免重复序列的出现;(3)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点。(1)避免基因间的同源性重复或同源序列是基因沉默的诱因,在构建表达载体时,应尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性,以减少或避免配对。应尽量使外源DNA碱基组成与植物DNA碱基组成一致,避免被植物限制修饰机制所识别。也可采用定点插入方
7、法,将外源基因插入到具有与其相似碱基组成的染色体区域。(2)避免重复序列的出现在筛选作为育种材料的转基因植物时,应尽量选择单拷贝插入的个体,来减少重复序列的存在。(3)在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点基因5’端和3’端非翻译序列及密码子周边序列都影响到基因的高效表达。起始密码子周边序列对翻译水平有明显影响,通常植物起始密码子周边序列有如下特征:AACAAUGGC,起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸。10.以叶绿体作为转化受体叶绿体的基因转录和翻译机制类似于原核生物,在叶绿体内的转化有如下优点:A.可能大量表达外源基因;B.叶绿体结构简单,
8、背景清楚,便于体外遗传操作;C.能更有效的控制外源基因,防止向环境释放。11.使用一些病毒编码蛋白最近研究证明一些病毒能编码某种抑制寄主基因沉默的蛋白质。克隆这些蛋白的基因,改造后与目的基因相连,转入植物时同时表达,可在
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