最新15新型PCR检测技术解析教学讲义PPT.ppt

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1、15新型PCR检测技术解析回顾上节课所学PCR五个要素①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的Taq④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤液态反应体系：其中Mg2+是DNA聚合酶的激活剂基本程序⑴94℃30s变性⑵50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑶72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑷25-35个循环基本内容一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理三、实时荧光定量PCR的原理四、实时荧光定量PCR与常规的PCR的差别五、实时荧光定量PCR的应用六、课堂小结七、

2、作业3、多重PCR的特点①高效性在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。②系统性多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检。③经济简便性多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例一肝炎病毒的感染，在同一病人体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染。有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙

3、型肝炎病毒重叠.一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例二肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例三性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.一、多重PCR4、多重PCR的应用（5个实例）例四某些遗传病及癌基因的分型鉴定。遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，通过常规PCR很难检测出来。例五植

4、物种质鉴定、植物病毒的检测、分子育种、快速检测外源基因的整合状态。一、多重PCR二、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。二、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR最常用于基因表达产物的分析，即将转录生成的单链mRNA逆转录成双链的cDNA,以此cDNA为模板进行反应。（动画）荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。1、荧光探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端

5、分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针二、荧光定量PCR的原理1、荧光探针二、荧光定量P

6、CR的原理1、荧光探针二、荧光定量PCR的原理2、荧光染料在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。二、荧光定量PCR的原理2、荧光染料二、荧光定量PCR的原理2、荧光染料二、荧光定量PCR的原理观看视频动画荧光探针特异性高探针设计要求高合成费用高多重PCR检出荧光染料简便易行价格便宜要求反应的特异性不能进行多重PCR二、荧光定量PCR的原理3、荧光探针和荧光染料的区别荧光探针SNP解析病毒、病原菌的检测荧光染料mRNA

7、表达量分析二、荧光定量PCR的原理4、荧光探针和荧光染料的用途三、实时荧光定量PCR的原理1、Ct值在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（临界值）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。2、Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。三、实时荧光定量PCR的原理三、实时荧光定量PCR的原理Ct起始拷贝数或起始浓度标准曲线三

8、、实时荧光