最新安捷伦1260高效液相色谱培训0305-药学医学精品资料.ppt

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1、最新安捷伦1260高效液相色谱培训20130305-药学医学精品资料概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。2色谱原理色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲

2、和）的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法3二、进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。1、进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱柱系统的压力、流量影响小。2、进样方式：隔膜泵进样、停留进样、阀进样、自动进样。三、色谱分离系统

3、色谱分离系统包括：色谱柱、固定相和流动相。其中，色谱柱是其核心部分。1、色谱柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。2、色谱柱的类型色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。a、常规分析柱（常量柱）一般色谱柱长10～30cm，内径为2～5mm（常量4.6mm，国内有4mm和5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。b、窄径柱（细管径柱、半微量柱）柱长10～30cm，内径1～2mmc、毛细管柱（

4、微柱）内径0.2～0.5mmd、半制备柱，内径>5mm。e、实验室制备柱，柱长10～30cm，内径20～40mmf、生产制备柱，内径可达几十厘米。注：一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。93、色谱柱的使用和注意事项A、避免温度和压力的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下会影响柱内的填充情况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流量时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。B

5、、应逐渐改变溶剂组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改为全部是水，反之亦然。C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会迅速降低柱效。D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以经常更换。F、

6、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接头拧紧，防止溶剂会发干。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内，静置过夜或更长时间。H、色谱柱使用过程中，如果压力升高，可能的原因有：色谱柱进口过滤芯被污染、冲洗阀过滤芯被污染、色谱柱被污染、连接管路的毛细管堵塞、进样器转子上的凹槽被污染、进样针或针座被堵塞。若发现压力升高，进行分段检查，排除故障。四．检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器

7、，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:（l）可变波长测器（2）荧光检测器(3)示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g·cm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（4）二极管阵列检测器性能/优点：灵敏度高、有四种类型的DAD模块选择、具有1024个二极管和可变狭缝、可根据需要选择不同的流动池、可进行自动峰检索、利用紫外谱图可进行色谱峰定性。(5)蒸发光散射检测器日常维护常见色谱故障----基线

8、噪音可能原因:a、检测池脏b、检测池灯能量下降c、由泵引起的脉冲d、检测器上的温度效应e、检测其中有气泡通过常见色谱故障-