最新单个核细胞分离PPT课件.ppt

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1、单个核细胞分离实验目的1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。免疫系统免疫器官免疫细胞免疫分子细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中常用的细胞群。【实验原理】人外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque比重1.077±0.001）混合分离液作密度梯度离心，离心后不

2、同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。Ficoll分层液聚蔗糖-泛影葡胺:商品名为Ficoll,其密度为1.077±0.001。主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。其主要成分:2份浓度为6℅、密度为1.020g/L聚蔗糖(商品名为Ficoll)与1份浓度为34℅、密度为1.200g/L泛影葡胺水溶液混合。用1.077±0.001的分层液可将细胞分离密度梯度离心(Ficoll)离心试剂与器材1.标本外周静脉血加EDTA-K2抗凝，或1000U/ml肝素抗凝血。2.淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺，比重(1.077±0.001）有商品供应。

3、3.Hanks液4.台盼蓝染液5.器材水平式离心机、显微镜、细胞计数板等。操作方法1.取静脉血放入抗凝管，摇匀，先作白细胞计数，然后取1.5ml加入等量Hank液，混匀。2.取1.5mlFicoll分离液置于灭菌离心管内，用毛细吸管将稀释血液3ml沿管壁徐徐加入离心管，使稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分层液与稀释血液体积比例为1：2），二者之间有一明显的界面。3.用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后管内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层4.用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管

4、壁周缘吸取该层单个核细胞，移入EP管，2000r/min5min离心去血浆，加1mlHanks混匀，2000r/min离心5min，弃上清液。5.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液体积用Hanks还原至1ml，取一滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞的回收率。×100%单个核细胞回收率=分离后细胞悬液ml×每毫升单个核细胞数全血ml数×全血中每毫升单个核细胞数单个核细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数─────────×10×103×2(稀释倍数)46.细胞活力检测取2滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片，显微镜高倍镜观察。细胞活力百分率=蓝色细胞数/100个

5、单个细胞数结果判断活细胞不着色，折光强，由于染料可渗入死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞应在95%以上。实验讨论1.注意事项①将稀释的血液加分层液上时，一定要细心，动作要轻，使分离液与血液的界面清楚，避免冲散分层液面或与分层液混合影响分离结果。②分离人和不同种类动物外周单个核血细胞要使用不同比重的分层液，分离人血所用分层液的比重以1.077±0.001为好；小鼠为1.088,而马则为1.090。③配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，有缓冲作用，并对细胞无毒性方法评价密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，用该方法不能除去其中的单核细胞。临床意义分离所得的单个核细

6、胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞，分离单个核细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一。穴位贴敷的相关知识罗文跃2016年一、概念穴位贴敷，是指在人体穴位之上，利用透皮吸收原理，作用于人体表面，缓解病痛。现在穴位贴敷广泛应用于临床，是一种安全的，稳定的治疗方式。二、穴位贴敷的发展历史早在原始社会里，人们用树叶、草茎之类涂敷伤口治疗与猛兽搏斗所致的外伤而逐渐发现有些植物外敷能减轻疼痛和止血，甚至可以加速伤口的愈合，这就是中药贴敷治病的起源。　春秋时期，穴位贴敷疗法的作用和疗效已有一定的认识逐步运用于临床，晋唐时期，穴位贴敷疗法已被广泛地应用

7、，清代则是穴位贴敷疗法较为成熟的阶段。建国以来，穴位贴敷疗法不但用于治疗常见病，而且应用于治疗肺结核、肝硬化、冠心病，高血压等以及其他疑难病种。三、作用机制（一）穴位的刺激与调节作用穴位通过经络与脏腑密切相关，不仅有反映各脏腑生理或病理的机能，同时也是治疗五脏六腑疾病的有效刺激点。运用穴位贴敷疗法，刺激和作用于体表腧穴相应的皮部，通过经络的传导和调整，纠正脏腑阴阳的偏盛或偏衰，对五脏六腑的生理功能和病理状态，产生良好的治疗和凋整作用