《单个核细胞分离》PPT课件

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1、2007级五年制本科生免疫学实验课杨巍第四次实验课人外周血单个核细胞分离实验内容人外周血单个核细胞的分离（实验）淋巴细胞分离与检测技术（讲解）实验目的掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法熟悉淋巴细胞的检测技术细胞分离纯化的目的测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；Ficoll密度梯度离心法常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡

2、胺(Urografin）分层液。红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)，离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。比重：1.070比重：1.077比重：1.092FicollFicoll密度梯度离心法实验材料分组：两人一组器材数量试剂数量滴管2支/2人分层液0.5ml/2人EP管1个/2人血液1ml/2人计数板1块/2人PBS1瓶/4人1ml刻度吸管1支/4人计数液1管/4人加样器(tip)1把/4人显微镜1台/2人实验步骤1

3、.加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)NOTE：不要打破血液与分层液的界面；2.分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层;3.回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次，4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清；4.计数：用500ulPBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）5.调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml。（NO

4、TE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以上为淋巴细胞，部分是单核细胞）示意图细胞计数方法查出四个大方格的总细胞数(X)算出每个大方格的细胞数：Y=X/4每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数(50)4淋巴细胞分离及检测技术巨噬细胞淋巴细胞DC细胞免疫细胞的分离——免疫细胞的分离原理及方法免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞的总称。直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞一.外周血单个

5、核细胞（PMBC）分离二.淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性纯化淋巴细胞亚群）E花环分离法尼龙纤维分离法免疫荧光法流式细胞术(flowcytometry,FCM)磁珠分离术免疫细胞的分离1.细胞膜脆性：低渗液分离2.细胞密度：密度梯度离心法3.细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术4.细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛免疫细胞分离的依据（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离血中的细胞单个核——PBMC无核——红细胞多核——多核白细胞PBMC的比重——1.075红细胞多核白细胞平均比重——1.092Ficoll淋巴细胞分层液比重——

6、1.077密度梯度离心法分离原理离心前示意图稀释的抗凝血Ficoll分离液血浆PBMC（白膜状）1.075Ficoll分离液1.077红细胞、多核白细胞1.092离心后示意图（二）T、B淋巴细胞的分离1、单核细胞的去除：（1）黏附去除法*原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。（2）L—亮氨酸甲酯去除法（3）羰基铁吞噬离心法2、T、B淋巴细胞的分离纯化（1）尼龙毛柱法**原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏附性的T细胞。（2）E花环分离法*原理：人成熟T细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受体（E受体），可结合绵羊红细胞

7、形成E花环，比重增大，沉于管底。（3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法E花环分离法人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细胞。（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞，即为巨噬细胞。免疫细胞的功能检测——功能检测的原理及方法免疫细胞功能

8、检测的意义免疫系统或其他系统的疾病，免疫接种，某些临床措施或外界环境的影响，均可使免疫细胞的数量和功能发生变化。因此，免疫细胞数量，功能检测，对于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、预防接种的效果评估及环境