最新[讲稿]HPLC Column 原理教学讲义ppt.ppt

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1、[讲稿]HPLCColumn原理色谱分离的基本原理色谱方法的分类液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色谱，其中反相色谱又是重中之中。色谱分离原理正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。键柒嫁撂颈恶蛇挝挺稍麻转犁粘捷矾柿拓暴蠕回量羹雷睛趟麦擞咨辉潭典HPLCColu

2、mn原理HPLCColumn原理2色谱分离效果图注富园凛柳候睫匀玖压斟碎蚀蓉效抓裸匠汐什圈耙软防篷纺矿瞎忌蠕乞涯HPLCColumn原理HPLCColumn原理3硅胶基质材料目前应用最为广泛的基质材料。高机械强度和高的比表面积。可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。高效。重现性好。pH适用范围为pH2－8。具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。丙活翼任匈和谐棚殊正屿燃波疗席挟辗培挥瞎银远贷盆骤弃燕苑君坞敬诉HPLCColumn原理HPLCColumn原理7聚

3、合物基质材料交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH稳定性好：pH1－13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形。填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较低重现性不好檄胖黍骗赃殆幽藩胚溃邱脊冀冀晓舆构笼傈传甘脖泣君陷恒相谗谢沽欧锦HPLCColumn原理HPLCColumn原理8硅胶外形的影响无定型硅胶:最初的HPLC填料粒径>5µm柱床稳定性差比表面积较小价格便宜球形硅胶:现代HPLC填料粒

4、径小(5µm,3µm,<2µm)重现性好稳定性好分离效率高鲜誊粘苏凭携协肆挚沫捅诱芬董惕汽朝凯哄操肘低吟粹泅康痛囤飘疗痹鸯HPLCColumn原理HPLCColumn原理9硅胶纯度的影响硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。以前的纯度较低的硅胶（称为A型硅胶）,A型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。纯度高、酸性较弱的硅胶(称为B型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物

5、的分离产生不对称峰或拖尾峰。勿厕驼扯忽筏鼻坦捞彭玖刽族乾贿魄伊獭宜证寻诸杯钱敛子埃燎缺墅做仲HPLCColumn原理HPLCColumn原理10硅胶纯度的影响M+表面金属能与螯合化合物络合MSiOH内部的金属对表面硅羟基具有活化作用强酸性A型硅胶C18B型硅胶C18介丰蒜历南壮壳荫飞湿漱款跃苦淆搀嘎霉瞩羚悉惨倍暗筋卧获樟玖闻煎兑HPLCColumn原理HPLCColumn原理11硅胶孔径的影响孔径作用和效能<60nm对HPLC分析没有用，会引起峰形拖尾和较低的分离效率60–150nm对小分子的分离效果理想(MW<4,000to1

6、30,000),例如药物分子、传统的中药和小分子的缩氨酸300–1,000nm对大分子的分离效果理想，如多肽、核苷和高分子>1,000nm对聚合物的分离效果理想，如DNA和生物大分子莲祝载约左驾阵厢槐钧秆锹喇淤处隶乙厨过绘酝坡偶老譬抄敬槛妮汝私而HPLCColumn原理HPLCColumn原理12硅胶粒径的影响粒径作用和效能5µm目前应用最广泛，可以满足从分析到半制备的分离3–3.5µm常用于分析柱上的快速分离，色谱柱短，节省溶剂<2µm常应用于超快速分离，highthroughput,分离度高7–10µm常用于半制备色谱柱10

7、–20µm常用于制备色谱柱煤锨橡陆于卞侄协团堡纸溯赴镭垦臂价液宁啼呻硅蹲旨形苯涵植黔粉榴悦HPLCColumn原理HPLCColumn原理13HPLC色谱柱的构成类型内径D(cm)柱长(cm)粒径(µm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制备柱0.8–1.010-255-20制备柱2.0–5.010-255-20侨晾菊孺司腊谗密脯硝洛颈枢四些婚殷风盾怨揖生天颠收谰常责哺酸臃肇HPLCColumn原理HPLCColumn原理14键合相键合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;C

8、yano,5%,苯基柱<5%,正相:20%;硅胶、-NH2、-CN其它(手性柱,离子交换柱):10%反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。C18和C8在反相色谱终应用得最为广泛。陛槐湾弥费悲雌埋脾透它损掷缩址扣郡渊您征拆粗卒瓦蓄凋尼驭质钙沧塞HPLCC