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1、HPLC方法开发有关样品组分和性质的重要信息现有组分的数目组分的结构以及具有的官能团组分的分子量组分的pKa值样品基质的性质：溶剂,填充物等要检测组分在样品中的浓度范围样品溶解度2分离目的是分析还是回收样品组分？是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？是否需要解析出样品的所有成分(例如,对映异构体,非对映异构体,同系物,低聚物,痕量杂物…)?如需定量分析，需要多高的精密度？3检测器检测器化合物类型UV/PDA最常用的检测器不适用于烷烃和糖类RID通用型检测器荧光检测器适用于能产生荧光的物质具有高选择性和灵敏度电化学检测器适用于易氧
2、化和降解的化合物具有高灵敏度和选择性电导检测器适用于可电离的化合物，如有机酸和无机酸柱前或柱后衍生化7选择一种HPLC模式对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的.离子对反相模式和正相模式是第二选择.具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条件.大分子量的样品,如聚合物,碳水化合物或蛋白质含有光学异构体的混合物(对映体)含有其他异构体的混合物含有无机盐的样品8影响HPLC分离的反相条件不同分离条件优先选择柱尺寸(长度,I.d.)15,25cmLx2-6mmID,粒径3-5um固定相C-8orC-18流动相溶剂A/BWater/ACN%
3、-B不定的缓冲液(化合物,pH,浓度)10-100mM磷酸盐,pH2-7添加剂(eg.,离子对试剂,氨)阳离子中加1-20mM高氯酸钠阴离子中加1-20mMTBA(四丁基铵）流速0.1-2ml/min温度10-60oC样品体积100ul质量100ug9主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱反相模式流动相：水/有机溶剂色谱柱:C-18(ODS),C-8,苯基,三甲基硅烷(TMS),氰基反相离子对模式流动相：水/有机溶剂,加一种缓冲液控制PH值离子对试剂色谱柱:C-18(ODS),C-8,氰基正相模式流动相：有机溶剂混合液色谱柱:硅胶,氨基
4、,氰基,二醇基何时应用此方法对于能溶解于水/有机体系中的中性或非离子化合物，首选该模式离子或可电离的化合物,特别是碱性或阳离子化合物当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择:首选为不溶解于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC(硅胶最好)10离子交换模式流动相：水相，另以缓冲液控制pH值色谱柱:阳离子或阴离子交换柱尺寸排阻色谱流动相：水相(凝胶过滤)有机相(凝胶渗透)色谱柱:二醇基（凝胶过滤用）聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗透用）分离无机离子混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及有关的化合物的良好的选择.分离高分子量样品，
5、如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G分子量的分布次要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应用此方法11改善分离两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs>1.5.对简单混合物，应使分离度Rs>2对含10个或更多成分的样品,分离度的要求可降到Rs>112开发HPLC方法的分离目的目的内容分离度精密和抗干扰的定量分析要求Rs>1.5分离时间小于5-10min时，日常工作较理想定量含量测定：RSD<1%;要求不高或痕量分析,RSD<5%压力最好<150kgf/cm2，<200kgf/cm2通常情况（假设是新柱）峰形最好是信噪比大的窄峰溶剂消耗
6、每个样流动相的消耗量越小越好13检查问题在方法开发期间，应重视方法引起的问题柱效下降谱带增宽样品的溶剂不适合高压引起的柱效下降高压样品前处理不当流动相或其PH值不适合14完善方法方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的有关实验室HPLC方法必须严格适合下列标准精确度准确度稳定性可转移性方法有效性检查对方法开发来说是非常重要的15开发HPLC方法的步骤1.有关样品的信息,明确分离目的2.是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等.3.选择检测器和检测器设备4.选择LC方法，进行预实验;评估分离条件5.最佳分离条件6.对特殊程序的问题和要求
7、进行检查7.对方法进行常规实验室有效性检查16检测器紫外－可见光检测器(UV/VIS)光电二极管阵列检测器(PDA)荧光检测器(RF)电导检测器(CDD)示差折光检测器(RID)电化学检测器(ECD)质谱检测器(MS)蒸发光散射检测器（ELSD）17紫外/可见光检测器EinEoutA=eCl=-log(Eout/Ein)lC:浓度朗伯－比尔定律(A:吸收)池18紫外/可见光检测器样品池参比池光电二极管光电二极管EinEinEin光栅D2/W灯lEout19朗伯-比尔定律A=eCl=-log(Eout/Ein)吸收浓度线性范围2.520光谱图2
8、75nm208nm275nm208nm21样品池512光电二极管阵列检测器光栅D2/W灯二极管阵列检测器一个元件检测一个波长下的所有吸收22二极管阵列检测器时间长波
