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1、DNA的提取方法简介从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些。细菌DNA分子量较大，一般达2×10道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。2.细胞的破碎由于高等动物DNA主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与
2、此类似）：①破碎细胞难；从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA可能会被DNase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA断裂。②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。3.DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相
3、中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白
4、质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶
5、于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.二.从猪脾中提取DNA1.操作步骤:取鲜猪脾,去脂、血,称取10g,用预冷的1×SSC溶液洗2次，剪碎。按睥：1×SSC=1;5W/V加入50ml预冷的1×SSC，用高速组织捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。将匀浆液放在烧杯中，于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离
6、心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1×SSC搅匀，离心，弃上清，重复2次。将所得沉淀悬于5倍体积的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%SDS最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol/L，继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿—异戊醇，激烈振荡20分钟，4000r离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿—异戊醇重复去蛋白2次。取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗DNA纤维2次，用95%乙醇洗一次，
7、再用乙醚洗一次，取出并挤干。2.实验材料，仪器和试剂：（1）实验材料：新鲜猪脾：（2）仪器：量筒：1×10、3×100烧杯：2×100，2×250；磨口锥形瓶：1×250、1×500；吸管：1×1、1×10；滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。（3）试剂：①20×SSC：175.2gNaCL，88.2g柠檬酸钠•2H2O，PH=7.0加水至1000ml；②1×SSC，0.1×SSC由①做相应的稀释得来；③NaCL-Na2EDTA液：8.77gNaCL，3
