最新6 分子生物学研究法(下基因功能研究技术-药学医学精品资料.ppt

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1、最新6分子生物学研究法(下)基因功能研究技术-药学医学精品资料6.1基因表达研究技术 6.1.3原位杂交技术(insituhybridization,ISH)原位杂交技术(insituhybridization,ISH):用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究。菌落原位杂交2荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术它利用荧光标记的核酸片段为探针,与染色体或DNA上特异序列杂交,通过与

2、荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。FISH技术检测时间短,检测灵敏度高,无污染,已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。3重叠延伸介导的定点诱变7大引物诱变法86.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统:是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术,可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。9酵母单杂交系统原理①将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。②将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体

3、导入酵母细胞。③该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。酵母单杂交的基本原理10从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。116.3.2酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)酵母双杂交系统:用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用,也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。完整的真核生物转录调控因子具有2个可分隔开的结构域:DNA特异结合域(DNA-bindingdomain,BD);转录激活域(transcriptionalactivati

4、ondomain,AD)一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有BD、AD,否则无法完成激活功能。12BD-XAD-Y共同表达于酵母细胞内AD、BD会形成完整的转录激活因子,并激活相应的报告基因表达。如果2蛋白能发生相互作用13酵母双杂交的基本原理示意图146.3.4细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(FRET)FRET荧光能量转移有三个基本条件:①给体与受体在合适的距离(1~10nm);②给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠;③给体与受体的偶极具有一定的空间取向。156.3.5RNAi技术及其应用RNAi(RNAinterference)技术:利

5、用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。16siRNA:小干扰RNAsmallinterferingRNA(siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸),与mRNA的互补区发生碱基配对作用,阻遏其表达。具有这种作用的短小单链RNA称~。这种作用称RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。17siRNA和相应的蛋白结合并形成活化的RNA诱导沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex,RISC),RISC进而识别和siRNA具有完全互补序列的mRNA,特异的降解mRNA。18196.

6、6其它分子生物学技术 6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌体溶原周期、溶菌周期表面显示(surfacedisplay):是一种基因表达筛选技术。是将“诱饵”蛋白基因克隆在特定的表达载体中,使其以融合蛋白的形式显示在噬菌体表面,直接用于捕获靶蛋白库中可与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。20重组噬菌体侵染宿主细菌后,复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒,直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。21THEEND!22压榨部结构简介压榨部概述造纸机压榨部的功能影响到纸机效率,运行性能、能源消耗、成本以及纸的质量等方面,是纸机重要的组成部分。一、压榨部的作用及压榨脱水机理二、压榨的

7、型式三、压榨部的主要结构四、压榨排列组合的选型压榨部一压榨部的作用及压榨脱水机理1.作用:压榨部的主要作用是用机械挤压的方法尽可能地除去纸幅中的水份,提高纸幅进入干燥部的干度。此外,压榨还可以改善纸的表面质量,提高平滑度、降低松厚度、提高湿纸幅强度。压榨部2.压榨脱水机理第1阶段:纸页和毛毯开始压缩,排出空气,直至纸页水分达到饱和,纸页中尚未形成脱水的推动力;第2阶段:纸页内压力上升,水由纸页转入毛毯,当毛毯达到饱和时,水从毛毯排出。第3阶段:压区开始扩大,直至纸页中水压力为零,

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