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1、4节--噬菌体抗体工程利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。一噬菌体展示的基本原理SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdispl
2、ayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.1985年Smith首次通过基因工程的手段,将外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g融合展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopeli
3、brary.Science,1990,249:386.噬菌体展示技术的突破T7噬菌体基因组由39936bp双链线性DNA组成，有160bp的突出末端。T7噬菌体衣壳蛋白通常有2种形式，10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341个氨基酸的翻译框中产生的(translationalframeshift)，约占衣壳蛋白的10%，功能性衣壳或者由10A、或者由10B、或者由10A和10B以一定比例构成，这说明T7衣壳蛋白能够容纳变异体。独特的10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用作
4、噬菌体展示。不像丝状噬菌体系统，展示在T7表面的多肽或蛋白质不需要通过细胞膜分泌出来，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广。T7展示系统可以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是目前最为理想的展示系统。VectorCloningRegionsOfT7Select10-3b与传统的质粒DNA疫苗相比,利用噬菌体展示技术研制基因工程疫苗具有独特的优势：噬菌体传递的DNA疫苗诱生的抗体应答持续时间更长,滴度更高；噬菌体有强的免疫原性，是天然的免疫佐剂；噬菌体疫苗在对核酸酶的稳定性方面的优势明显，而且噬菌体疫苗能直
5、接靶向抗原提呈细胞，使用比质粒DNA疫苗低得多的剂量就能诱发很好的免疫效果。还体现于甚至在病原体不够确定、极度危险或不易获得的情况下,如研制SARS(又称“非典型肺炎”)疫苗,同样可通过获得特异性抗病原体抗体进行肽库筛选,设计有效、特异、安全的模拟肽疫苗,具有抗烈性传染病疫苗设计的巨大优势。噬菌体展示技术研制基因工程疫苗的优劣噬菌体展示疫苗十分有希望,但其技术存在一定的内在的限制性,例如,在传递噬菌体衣壳蛋白-疫苗肽融合体时,不是所有的构象活性表位都能被保留下来？此外，噬菌体生长于原核细胞，因此噬菌体疫苗将
6、缺少真核细胞翻译后的糖基化信号。二噬菌体抗体库的种类根据抗体基因来源组成的不同,抗体文库大致可分为4种:①天然抗体文库(nativeantibodylibrary),抗体基因片段来自未经免疫的供体,该文库代表了供体内天然的抗体谱;②免疫后抗体文库(ImmunizedantibodyLibrary),抗体基因片段克隆自经抗原免疫过的供体,该文库一般具有较强的抗原特异性和亲和力;③半合成抗体文库(Semi-syntheticantibodyLibrary),该文库抗体重链可变区基因片段中CDR1和CDR2来自人
7、胚系VH片段,而CDR3则是人工合成的编码5～15个氨基酸的随机序列,该文库容量极大,可达1012,但抗体的亲和力较低,同时人工合成的CDR3可能增加抗体的免疫原性;④合成抗体库,是在对人或鼠抗体的序列和主体结构进行分析的基础上,合成多条VH和VL基因,用来替代所有的抗体类别和结构,组成多个总抗体库,其CDR区可通过限制酶方便地更换,该库便于进行分子模拟和结构预测,不足之处是操作复杂,且所获得抗体的免疫源性往往较高。噬菌体抗体库综合运用了3项实验技术①RT-PCR技术,使人们可以用一组引物克隆出全套免疫球蛋
8、白可变区基因;②成功地采用大肠杆菌分泌表达具有生物活性的抗体功能片段;③噬菌体表面展示技术的建立,目前建库采用较多的噬菌体载体是pComb3及pCANTABLE,其主要技术流程是,先从脾或外周淋巴细胞等提取RNA,采用与抗体可变区基因两侧保守区互补的引物,通过RT-PCR分离扩增抗体的轻、重链基因片段,再经过随机重排组合,将基因片段克隆λ噬菌体载体中,组成噬菌体抗体文库,库中每一个噬菌体在其表面可表达一种特异性抗
