最新4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项幻灯片.ppt

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1、4流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项标本种类临床标本鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等血清标本病人的急性期和恢复期血清双份血清流感病毒标本采集临床样本的选择采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物）、人禽流感待查病例流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者，而缺乏其它的实验室确定诊断依据采集时间：病人发病后的头三天流感病毒标本采集临床样本收集的注意事项操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物采集标本要有一定力度标本采集后应迅速至于冰

2、上或者4℃以下保存，因为流感病毒对热很敏感标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，采样日期标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70℃或以下流感病毒标本采集血清学标本注意事项血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清采集空腹血流感病毒标本采集标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧；将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本；在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一

3、塑料袋密封；将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。所有容器必须有生物危险标识。临床标本的包装流感病毒临床标本的运送要求新鲜的临床采集标本应在4℃条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室;未能24小时内送至实验室的，应置-70℃或以下保存冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出鼻腔或咽部洗液的标本:充分振荡标本管

4、，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5～10分钟，取上清5ml。上清液可直接接种或低温保存临床标本的处理方法临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40％）用于鸡胚接种，一份（30％）用于MDCK细胞接种，一份（30％）保存待复核用。对于病毒分离阳性的标本－70℃保存6个月临床标本的处理原则流感病毒的分离样本采集鼻咽拭子或含漱液双份血清快速诊断血凝抑制试验或中和试验分型鉴定病毒分离2021/8/214标本接种注意最好24小时内进行病毒分离病毒分离标本实验室的保存条件24小时内进行病毒分离，4℃保存24～48小时

5、内不能进行病毒分离的－70℃或以下保存病毒分离注意事项常采用鸡胚和MDCK细胞分离方法流感病毒分离：生物安全二级实验室禽流感病毒分离：生物安全三级实验室病毒分离方法正常细胞病变细胞病毒分离注意事项细胞分离流感病毒选择敏感MDCK细胞细胞70～90％成片TPCK－胰酶7.5%BSA鸡胚分离流感病毒9日龄SPF鸡胚尿囊腔和羊膜腔接种：季节型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接种分离病毒人禽流感病毒尿囊腔分离病毒不同胰酶TCID50检测结果TPCK-胰酶与普通胰酶的比较MCDK细胞代数TPCK-胰酶普通胰酶21代8.753.5

6、46代93.5MDCK细胞敏感性试验结果MDCK细胞代数TCID5019代921代935代9.541代945代9MDCK细胞TCID50检测结果使用TPCT-胰酶,A/北京/西城/156/2006(H3N2)C4用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉流感

7、病毒操作要求生物安全规程禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存流感病毒实验室交叉污染的避免流感病毒鉴定鉴定方法血清学方法红细胞凝集及凝集抑制试验神经氨酸酶活性及抑制试验其它方法核酸检测快速检测试剂盒流感病毒鉴定红细胞凝集和红细胞凝集抑制试验流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其

8、结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现使用的试剂可靠无误红细胞悬液浓度是否合适处理后的血清有无残余非特异性凝集素选用标准抗血清是否准确读取HA试验的结果是否正确4个血凝单位是否准确红细胞阴性对照待鉴定病毒确保没有被细菌污染稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确红细胞凝集抑制试验注意事项流感病毒核酸检测流感病毒实验室检测方法比较实验方法优缺点病毒组织培养（