western显影时荧光淬灭太快原因和对策.doc

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1、western显影时荧光淬灭太快原因及对策降低二抗浓度，然后这样做：在一张保鲜膜上面把NC膜铺上去，然后直接在NC膜上加入发光液（可以是理论量的一半，否则后面盖上膜后会溢的到处都是），不要吸干直接将保鲜膜盖上拿去显影，可以托比较长的时间（当然，淬灭的主要原因是单位面积上HRP的高度密集，使NC膜上残留的发光液被高速消耗，所以上面这个方法的原理就是降低NC膜单位面积上HRP的密度，同时提供尽可能多的发光反应液，使反应不会在短时间内结束——但是即便如此还是建议尽快压片！）在显影底物用到快见底的时候，我也遇到过这样的情况，后来用新的一瓶又持续发光超

2、长时间，所以推测是显影底物不行了。哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）1.保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。b.保鲜膜的化工原料或拉制过程中

3、，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，

4、但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此，按照我的方法，让自由流下的多余的ECL被吸走就好。3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗，呈线条状淬灭。4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号的强弱，这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿

5、不到这种情况下的荧光信号）造成的；有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能导致白板，根本无法判断。除上述的问题以外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？1.抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。2.抗原浓度太低

6、，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。3.ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。4.操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。5.不良的实验习惯。坛子上曾经有人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影

7、液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接导致无荧光；只要有任何失误，诸如不小心刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实（其实通常还真的不严实，因为你不可能包裹好几层）。于是，我问他用一个很脏的东西不觉得很别扭嘛，为什么不先抄起抹布擦干净再用呢。6.淬灭的假象。少量沾在膜表面的二抗也会激发荧光，但ECL孵育时稍微晃动就消失了，可能产生淬灭的错觉。化学发光很快淬灭的原因很可能是由于你的HRP反应过于强烈所致(如蛋白上样量过高、一抗和二抗的浓度太高)。我本人也有这样的体会，尤其是做如GAPDH这样的表达量很高的蛋白的时候，如果抗体的稀释倍数和以前的一

8、般条件一样的话，就会出现你说的这种情况。最后的结果是在暗室里紧张得满头大汉却只保住有限几张的片子。而且在这种情况下，PVDF膜上也能看到淡黄色的条带Q：为什么Wes