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《本土酿酒酵母低温耐受性主效QTL的定位及克隆鉴定.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、本土酿酒酵母低温耐受性主效QTL的定位及克隆鉴定葡萄酒低温发酵是提高葡萄酒品质、丰富葡萄酒香气的重要手段,已成为现代葡萄酒工艺革新的研究热点。低温发酵能否顺利进行,主要取决于酿酒酵母的低温耐受性。因此,研究酿酒酵母低温耐受性的遗传基础,对优良耐低温酿酒酵母的筛选、遗传改良和应用,提高葡萄酒品质,提升我国葡萄酒的竞争力具有重要意义。本研究以我国本土酿酒酵母为研究对象,利用全基因组测序技术与分离群体分组分析（BSA）相结合的QTL定位方法,对酿酒酵母低温耐受性的主效QTL进行定位,并通过相互半合子分析（RHA）、序列多态性分析以及等位基因替换等方法对主效基因进行鉴定。主
2、要研究结果如下:1.通过分析来自我国5个主要葡萄酒产区的68株本土酿酒酵母在低温下（16℃、12℃、8℃、4℃）的发酵能力和生长状况,研究本土酿酒酵母的低温耐受能力。结果显示:在各温度下,酿酒酵母的最大比生长速率基本遵循正态分布,而且随着温度的降低,酵母的生长逐渐受到抑制,最大比生长速率大幅度降低,菌株之间的差异也越来越大,同时菌株的发酵能力也随着温度的降低而降低。Wb-3-40、ZX11、ZX13相比其他菌株生长状况优良,产气较快,低温耐受能力较强;而菌株31y3、NX9412、112y4在低温条件下生长状况较差,产气较慢,发酵受到了严重抑制,其耐低温能力较弱。这
3、些菌株可作为后续低温耐受性遗传基础研究的出发材料。2.利用Cre-loxP重组系统敲除6株低温耐受表型差异显著的二倍体酿酒酵母的HO基因,分离其单倍体,筛选表型极端的单倍体菌株,并对其进行营养缺陷型改造。结果显示:通过表型筛选,获得两株表型差异极端的单倍体菌株ZX11（6）（MATα,ho）和NX9412（4）（MATa,ho）,在4℃下的最大比生长速率分别为0.0143和0.0025,作为杂交的耐受亲本和敏感亲本;成功构建亲本的营养缺陷型菌株ZX11（6）（MATα,ho,ura3::KanMX4）和NX9412（4）（MATa,ho,ura3::KanMX4,l
4、ys2::URA3）,二者分别具有稳定的尿嘧啶、赖氨酸营养缺陷遗传性状,且低温耐受性与原始菌株无显著差异。3.将两株低温耐受性表型极端的单倍体亲本杂交,构建F2分离群体,并对每个个体进行表型测定,选取两组表型差异极端的后代个体分别构建混池,通过混池测序,检测与低温耐受性相关的主效QTL。结果显示:构建F2分离群体共计500株,并获得由21株低温耐受个体组成的“耐受池”和23株低温敏感个体组成的“敏感池”;亲本间共有14,618个SNP多态性位点,通过分析两个子代混池的SNP频率差异,检测到两个与酿酒酵母低温耐受性相关的QT
5、L,分别位于Ⅳ号染色体和XV号染色体。4.利用RHA、序列多态性分析以及等位基因替换、定点突变方法对两个QTL区间内的候选基因进行鉴定。结果显示:NAT1和YOR365C是酿酒酵母低温耐受性的主效基因。其中NAT1基因与蛋白质的乙酰化修饰过程有关,YOR365C的蛋白功能未知,利用SMART在线蛋白结构域分析软件工具,对YOR365C的蛋白结构域进行预测,发现其参与细胞壁的合成。序列多态性分析发现,两个亲本的NAT1编码区存在两个引起氨基酸非同义突变的核苷酸变异,其中一个突变位点（T1187C）在其它28个已知全基因组序列的酿酒酵母菌株中均不存在。经过定点突变和突变
6、型等位基因的替换试验发现NAT1T1187C能够重建耐受亲本ZX11（6）背景NAT1基因敲除菌株的低温耐受表型,因此该位点的核苷酸多态性是控制酿酒酵母低温耐受性的一个数量性状核苷酸（QTN）,该QTN引起相应的氨基酸变化（F396S）,提高菌株耐受低温的能力。将原低温敏感二倍体菌株NX9412的NAT1基因替换为等位基因NAT1ZX11（6）后,能显著增强其低温耐受能力。
