2基因工程制药(1)

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1、第二章基因工程制药基因工程是将一种生物的基因分离出来，在体外进行酶切和连接插入载体构成遗传物质的新组合，导入另一种宿主细胞使目的基团得到复制和表达的技术。基因工程可生产的主要药物是指医用活性蛋白和多肽，包括免疫性蛋白、细胞因子、激素、酶等。2.1基因工程药物生产的过程2.2目的基因的获得2.3基因的表达2.4基因工程菌生长代谢的特点2.5基因工程菌的稳定性2.6基因工程菌的发酵2.7基因工程药物的分离纯化2.8包含体的复性2.9基因工程药物的质量控制2.1基因工程药物生产的过程获得目的基因重组质粒构建基因工程菌除菌过滤产物分离纯化培养工程菌包装成品检定半成品

2、检定基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体、宿主上、下游2.2目的基因的获得一、构建基因文库提取细胞基因组DNA酶切克隆至特定载体杂交或其他方式筛选基因文库转化特定宿主细胞探针(如根据氨基酸序列反推过来的DNA序列，根据蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分DNA序列)获取目的基因适合于无内含子的原核生物二、构建cDNA文库适合于真核生物基因克隆。提取细胞mRNA反转录合成cDNA第一链cDNA第二链的合成杂交筛选或其他方式筛选cDNA文库转化特定宿主细胞探针获取目的基因cDNA片断与载体连接三、PCR方式先决条件：已知目的基因的DNA序列。原核：以基因组

3、为模板反转录PCR（RT-PCR）：提取mRNA，反转录生成cDNA作为模板进行PCR扩增获得目的基因。四、化学合成已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因。2.3基因表达基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译及所有的加工过程。一、宿主细胞的选择首要条件：能够生产出有活性的目的产物。其他条件：容易获得较高浓度的细胞；产物的产量、产率高；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；容易进行DNA重组技术操作；产物容易提取纯化。表达系统的分类：1、原核表达体系（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。革兰氏

4、阴性菌优势：遗传背景清楚，基因组序列已确定；生长迅速，平均20~30min繁殖一代；易于培养，生产成本低，适合大规模培养；外源基因表达水平高，可达总蛋白的5~30％以上；有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。缺点：缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能；没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制；表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难；翻译目的蛋白N端常多一个甲硫氨酸残基（AUG编码）。（2）枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌，其基因组测序已经完成。胞外分泌能力强；有很多可用的质粒载体；无糖基化功能；具有很强的胞外蛋白酶活性，对目的产物有不同程度降解。（3）链霉菌优

5、点：对人畜基本无致病性；已发展了一大批有实用价值的载体质粒；链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌的基因组测序已完成；具有很强的外分泌能力；表达蛋白基本能正确折叠，不形成包含体；具有糖基化功能为重要的工业微生物，下游培养工艺成熟。缺点：对其分子生物学研究不深入；对外源基因表达的影响因素，特别是分泌机理还需系统研究。2、真核表达系统（1）酵母单细胞生物，无毒，易培养，繁殖快。具有分泌功能，能够糖基化。以往多采用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作为表达系统，近年来采用毕赤酵母（Pichiapastoris）表达蛋白增多。毕赤酵母转录外源基因的启动

6、子来自于毕赤酵母醇氧化酶I（AOX1）的启动子，受甲醇的严格调控，可使外源基因高效表达。毕赤酵母的特点：为真核表达体系，可进行翻译后修饰；表达量高，明胶的表达量可达14.8g/L;比其他的真核表达体系培养成本低，只需要含盐的简单培养基；适于高密度培养，菌体干重可达100g/L以上。杂蛋白较少，产物纯化容易。为了最大限度的稳定毕赤酵母表达菌的稳定性，已构建的毕赤酵母载体均为整合型载体；转化前在限制性内切酶单酶切位点进行酶切使载体线形化，然后转化毕赤酵母，线形化的载体与酵母染色体发生同源重组插入到染色体中。常用载体：非分泌载体（pAO815、pPIC3K、pPI

7、CZ等）分泌型载体（pPIC9K、pPICZα等）（2）丝状真菌近年来在30种以上丝状真菌中建立了DNA转化体系。（3）昆虫细胞表达体系以昆虫细胞为表达宿主。（4）哺乳动物细胞表达系统以中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和非洲绿猴肾细胞（COS）细胞使用最多。优点：糖基化的基因产物接近或类似于天然产物，可分泌表达。缺点：生长速度慢，培养条件苛刻，成本高。二、大肠杆菌中的基因表达1.有效的表达载体2.密码子偏好性3.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位4.蛋白降解5.融合表达6.分子伴侣1.有效的表达载体典型的大肠杆菌表达载体主要包括：启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录

8、及翻译信号、质粒复制起点及抗性基因。1.有效的表达载