丝状真菌表达分泌系统中受体菌构建

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1、!"卷#期生物工程学报&’()!"*’)#$%%$年!!月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*’+,-.,/$%%$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建!$!!!"刘丽刘谨仇润祥朱兴国唐国敏（!中国科学院微生物研究所，北京!%%%"%）（$山东大学，济南$1%%%!）摘要黑曲霉糖化酶高产菌株5$!经紫外诱变后，通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋

2、白酶活力仅为原株%C4#D的菌株3)$#1%*5$!0$%!，其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体0E7F法将含有报告基因4"5的表达分泌质粒GF5!%04"5通过与选择标记质粒的共转化导入此蛋白酶部分缺陷株及其原株5$!，检测在蛋白酶缺陷株3&6%*1#,,)&$#1%*5$!0$%!和原株5$!中&H.的分泌表达，结果表明在3)$#1%*5$!0$%!中&H.表达水平显著高于原株，但*’/:@,/B.(’:却显示在两菌株中4$5基因的转录水平近似，由此证明酸性蛋白酶缺陷对保护外源蛋

3、白产生了显著效果。关键词黑曲霉5$!，蛋白酶缺陷株，&H.，表达0分泌中图分类号I4"#文献标识码J文章编号!%%%03%#（!$%%$）%#0%##40%2黑曲霉作为外源基因表达系统比其它微生物表种保存、活化，用查氏培养基。黑曲霉发酵培养基达系统（细菌，酵母）具有如下的独特优点：高分泌#D淀粉，$D酵母粉，%C1DUH$EV2，%C1D玉米粉。性能，高强度启动子，完善的翻译后加工及成熟的检测蛋白酶分泌活性的酪蛋白平板成分为!D酪蛋发酵工艺。但黑曲霉自身蛋白酶对外源蛋白的降解白（溶于GH2C%的%C!

4、-’(WT乳酸缓冲液），!D明胶成了提高目的蛋白产量的主要障碍。实践证明，通和!C$D琼脂。检验淀粉水解酶分泌的淀粉平板成过诱变或基因敲除来筛选蛋白酶缺陷株，是克服这分为!D淀粉，!D明胶和!C$D琼脂。糖化酶活性［!，$］一障碍的行之有效的方法。黑曲霉糖化酶高产测定按常规，!个单位定义为34X作用于可溶性淀株5$!除具有高强度能诱导的糖化酶启动子和内源粉每分钟产生!葡萄糖的酶量。黑曲霉原生质体!;蛋白高分泌能力外是已知的抗葡萄糖阻遏突变株，制备的前培养基成分为!D淀粉，$D酵母粉，!D因此以黑曲霉5

5、$!作为基因工程受体菌的改造集中葡萄糖，%C1DUH$EV2，%C$1D玉米粉，%C$1D豆于筛选蛋白酶缺陷株。本文即报告蛋白酶缺陷株的粉。黑曲霉转化培养基是以!-’(WT蔗糖为渗透压筛选及其作为丝状真菌表达宿主的应用效果。稳定剂的查氏培养基。其中以乙酰胺为选择标记的!材料和方法培养基去掉*8*V另含%C%!-’(WT乙酰胺和3!"!材料%C%$-’(WTYNY(，以潮霉素Q为选择标记的查氏培养!"!"!菌种：3)$#1%*5$!由本组保存。基另含$%%!;W-T潮霉素Q，转化用的上层软洋菜培!"!"

6、#质粒：G3KL$，含乙酰胺酶基因+789，M/)养基成分除%C#D琼脂外，其它与下层培养基相同。H?B,N惠赠；GOP!，含潮霉素Q磷酸转移酶基因!"!"%酶及其它试剂：T?N9B;,BZ?-,和A,(([(8N,购"6"，M/)RSAR惠赠；GF5!%为丝状真菌表达分泌载自K9;-8公司。酪蛋白购自K9;-8公司。体，GF5!%04"5为插入报告基因4"5（编码细菌血红!"#方法蛋白）的表达分泌载体质粒，由本组构建（待发表）。!"#"!5$!紫外诱变：参照文献［3］进行。取培养!"!"$培养基：细

7、菌培养用TQ培养基。黑曲霉菌好的斜面，加入无菌水约$3-T，将孢子刮下，玻收稿日期：$%%$0%10!2，修回日期：$%%$0%"03%。基金项目：本工作为国家自然科学基金资助项目（*’)3%!4%%!2）。"通讯作者。5,(："#0!%0#$#$636"；70-89(：:;-<8=>?8@’’)A’-)AB//>生物工程学报">卷璃珠打碎，!层纱布过滤，获得单孢子悬液，调整孢蛋白酶活力仅为原株的#)(/2，进一步对BGJ3#"进$子浓度至约"#个%&’，涂布查氏培养基平板，行了发酵培养和在添加了"

8、2的3:脱氧葡萄糖的培"##!’%皿，置紫外箱中，灯管距平板"()*+&，功率养基上的生长试验，以观察其培养特性和测定糖化!#,，照射!*-，然后置$#.培养箱中培养/0(1。酶产量，结果均与原株基本一致（表3），因此可以认从致死率约为(#2的平板挑取菌落接种保存。为BGJ3#"的生长能力，糖化酶的转录机器，蛋白分!"#"#部分蛋白酶缺陷株蛋白酶活力的测定及其泌能力和蛋白加工形成成熟蛋白所需的内肽酶发酵特性试验：将上述各诱变菌株斜面培养物接种UEVRR和