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1、·222·《医学综述》20。。年第6卷第5期细菌内毒素检测方法的研究进展解放军第251医院(北戴河066105)胡金川综述第四军医大学西京医院分子生物学研究心于文彬马越云审校中19世纪,Peffier首先提出“内毒素”一词,是指革兰阴性细菌培养滤液中具有生物活性的热稳定物质。后来几十年的化学研究表明,内毒素的主要成分是脂多糖(lipopolysaeeharidle,IJPS),多存在于革_、全阴性杆菌和球菌细胞壁中,是一个复杂的大分子,含有与多糖共价结合的脂类,即类脂A。类脂A是LPS的“毒力中心”,在生物活性中起关键作用。内毒素
2、是许多疾病的病因,其中败血性休克最为常见。由于侵袭性医疗程序和免疫抑制剂应用的增多,革兰阴性菌败血症的发病率正逐年增加〔’·”〕。据统计,在过去的20年中,美国革兰阴性菌败血症的发病率增加了01倍,达到01万~03万人.其中休克的发病率为02%~04%,病死率57%川。因此,内毒素的检测显得非常重要。1内毒素的化学结构内毒素是一个异质多聚体,整个分子可以分成三个明确的区域:¹0特异多糖侧链;º核心寡糖;»类脂A。0特异侧链由重复的寡糖单位组成,每个寡糖又由2~6个单糖组成。寡糖单位内的碳水化合物残基构成每种内毒素和革兰阴性菌所特有
3、的特异性抗原决定簇,表达各自独特的抗原性,而在一些细菌中可存在共同抗原。核心区是一个分支寡糖,离类脂A远的外核区经常出现的糖为葡萄糖、乳糖和乙酞葡糖胺,而临近类脂A的内核区由庚糖、2一酮基一3一脱氧一D一甘露醇型一辛酮糖酸(IJ一keto一3一deoxy一D一manno(tonate,KD())组成,后者通常带有电荷残基。核心寡糖的变异性很小,因此,这部分有较高保守性。内毒素核心寡糖的免疫决定基,取决于核心成分末端的糖残基结构,不同种属的细菌,甚至不同类型的微生物,只要其产生的内毒素核心结构一致,即具有血清学交又反应性。有些革兰阴
4、性菌在内毒素的生物合成L发生缺陷,缺少0侧链和部分核心寡糖。和那些有0一抗原的细菌光滑菌落(S株)相比,这些突变株的菌落形态显得粗糙,因而被称为粗糙株(R株)。随着缺陷位点的不同.分为Ra一Re型。类脂A是内毒素结构中最保守的部分,由磷酸葡糖胺双糖主链和与之结合的长链脂肪酸组成,通过一个酮昔键与核心区的K以)相连。这个键对酸水解极为敏感,因而类脂A很容易和核心寡糖以及0侧链解离。在溶解状态时,游离的类脂A具有完整内毒素的大部分毒性作用。2内毒素的检测2.1传统方法2.1.1家兔热原试验法(rabbitpyrogentest,RT)
5、此法即将一定量的被检标本静脉注入家兔体内,观察其注射后的发热情况,以决定所检标本中有无热原存在。RT法为一种定性检测内毒素的方法。此方法本身有许多限制,如家兔对内毒素在反应上有个体差异,敏感度不高,不能定量测出内毒素等闹。2.1.2赏试验法(IJimulu、test,IJ‘F)IJT法又称赏变形细胞溶解物试验(x脚imulusamoeboeytelysote,I·AIJ),是目前国内应用最广一、最敏感的方法。赏系海J尔动物,其血液中含有一种特殊的变形细胞。这种细胞中含有能被内毒素激活的C因子、B因子、前凝固酶,从而反应形成凝胶块
6、。1964年.Lveni和Bang川根据这一原理建亿了LT法,它比RT法敏感01~10倍以上,可测出微量的内毒素(0.0一l拌g八J)水平。在此基础上,人们建立了多种方法.有试管法、毛细管法、玻片法和干涸法等。丁振若等川将试管法、毛细竹法、玻片法和干涸法对正常人和发热患者的血浆和腹水进行了测定和比较,认为试管法不适用于临床;玻片法消耗试剂量少,方法简易,但终点不明显,结果不易判断,易出现假阳性,临床应用缺点也较多;而干涸法和毛细管法,既有敏感性和特异性,终点判断又界限清晰,方法简易。总的来讲,这些方法均为半定量方法。1978年,日
7、本Haarda等首创用基质显色LAI才法(chrom叩eni。limulusameoboeytelysate,el,Az才)对内毒素进行定量测量闹。此后,在文献报道中,出现了多种技术改进。这些方法均是加入多种试剂添加剂的终点方法:pH6.。~7.5条件下,内毒素激活LAIJ前凝固酶,pH8.0~9.。时,通过分解产色基质酶作用物的能力测量激活酶的量,加入醋酸终止反应〔61。eohe。等〔,1应用成色动力学定量检测内毒素。然而,经考察研究,内毒素激活LAI才酶系统后产色动力学并无优于其他终点法之处。1984年,Urbasehek等阳
8、]阐述了第一个真正的研究60分钟吸光度变化的成色动力学方法。然而,这种方法仅用于测量低浓度内毒素,可以达到Zng八J,研究发现它无优于比浊法之处。终点成色法和终点比浊法,测量范围小,而浊度动力学方法成功地利用了LAIJ前凝固酶内毒素激活的动力学,把
