液相色谱操作.doc

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1、液相色谱根据目前市场情况主要分进口和国产两大类，进口主要有美国产Waters（实验室存有Waters1525价格：35.6W）、安捷伦（实验室存有Aglient1200价格34.5W）、塞尔泰、戴安、日本岛津等系列；国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列。液相色谱仪结构主要由贮液器、高压输液泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。1．贮液器：使用四元泵时（Aglient1200），A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流

2、动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。在最后通常还有一个废液瓶。使用二元泵时（Waters1525），B相位于下方，通常放置盐溶液，A相位于上方，放置有机溶剂，可使用普通玻璃溶剂瓶贮存流动相。附流动相使用注意事项：1）流动相的纯度要求：有机溶剂必须是色谱纯，水必须是超纯水且现从纯水机中取出不能过夜，缓冲溶液需现取超纯水配置，并经过0.45um滤膜（注意水相膜与油相膜不能混用）过滤除去其中的颗粒杂质和其它物质。任何流动相使用前都要经超声脱气，脱气后恢复到室温才使用。流动相使用不当引起的问题：流动相不纯会增加检测器噪声从而影响检测结果，

3、长期积累会堵塞柱子；脱气不彻底有气泡会导致压力不稳，重现性差。2）流动相与固定相不能相互作用，否则造成柱效降低甚至损坏色谱柱。　3）样品必须溶于流动相，否则会堵塞柱子。4）使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2．高压输液泵流动相由高压泵输送和控制流量。泵由入口单向阀、出口单向阀、柱塞杆、密封圈等组成，是液相色谱仪的重要组成部分，是导致HPLC的高压、高速、高效特点的主要部件。1）使用前先进行排气purge。Waters1525：先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约5mL流动相，再打开参比阀（向右搬），点击purge图标，冲洗泵5min（一般是默认5min

4、，之后仪器自己停泵），待停泵后，压力和流速都降至0后，才能关上参比阀（向左搬紧）。Aglient1200：逆时针松开参比阀，通过软件设置流速，从0上升至5mL/min，保持至少10min。2）若使用缓冲液，工作结束后需用超纯水清洗泵中残留的缓冲液。3）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中。3．进样器：通常采用高压六通阀进样装置。手动进样：1）进样图标出现2）进样阀“Load”装样3）针先排汽泡。4）进样5）搬injected计时约10s，否则会倒流6）图标消失，拔针7）洗针（用溶剂洗）4．色谱柱使用注意事项：1）柱子使用pH范围。C18反相柱一般适用的样品pH范围在2~8，

5、故一定要精确调节好缓冲液的pH值和样品的pH值，并注意缓冲液的浓度不得超过0.02mol/L。2）柱子使用压力范围。正常状况下流速会逐步上升，柱压也随之逐步上升直至维持较稳定的范围，最高压力不超过4000Psi，注意结合每根柱子的使用说明，每天都要记录柱压。3）柱子使用流速范围。根据不同色谱柱设定相应的流速。1）柱子方向不能接反（否则会冲坏固定相）。2）使用缓冲液时，做完样品后应立即用超纯水冲洗管路及柱子1小时，然后用甲醇冲洗40分钟以上，以确保整个管路及柱子保存于有机溶剂中。3）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相

6、（如甲醇等），因为纯水易长霉。5．柱温箱:控制温度，Waters1525一般设置柱温30~40℃，高于室温5℃，但必须打开示差检测器；Aglient1200可设低于室温10℃，最高可设定80℃。6．检测器：UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外-可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，但是梯度洗脱时，还会产生漂移。紫外检测器一般针对有紫外吸收的样品的检测，其波长设置在样品的最大吸收波长处。开机操作附1：Waters-1525液相色谱仪操作详细规程1、使用人提前一周于精密仪器室进行预约2、登记仪器使

7、用记录，擦拭桌面灰尘，检查废液瓶（有残留的话，及时先倒至卫生间）。3、打开柱温箱检查是否为所要使用的柱子（换柱子要注意流动方向），然后依次打开柱温箱、1525泵，2487紫外检测器和2414示差检测器，等待8min，以便进行内部校正和诊断测试，检测器需要预热20min。注意纯水机的蒸馏水每天更新一次。4、准备好自己所需的流动相，并用超声波清洗器脱气30min。5、换上已脱气流动相，启动电脑，连接Breeze软件，左下角蓝色进度条完成即表示联机成功。先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约5mL流动相，再打开参比阀（向右搬），点击purge图标，冲洗泵5min（一

8、般是默认5