外源DNA残留量测定(荧光定量PCR法)标准操作规程SOP.docx

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1、外源性DNA残留量测定法（荧光定量PCR法）标准操作规程文件编码：XXXXXX目录1.目的12.范围13.职责14.依据15.定义16.内容16.1.原理16.2.实验材料26.3.操作步骤36.4.结果计算66.5.判定标准76.6.注意事项77.相关文件78.附件79.变更历史71.目的1.1.规范外源性DNA残留量测定法（荧光定量PCR法）的操作过程。2.范围2.1.本规程适用于采用荧光定量PCR法对CHO细胞表达产品进行外源性DNA残留量的测定。3.职责3.1.方法学研究员负责严格执行本规程规定；3.2.质量研究室负责人负责本规程的培训并监督本规程的执行。4.依据4.1.D

2、NA残留量检测样品处理试剂盒（PrepSEQTMResidualDNASamplePreparationkit，AppliedBiosysterms）使用说明书。5.定义5.1.LTR：longtandemrepeat，长串联重复序列5.2.PCR：PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应5.3.Ct：阈值循环，即荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数6.内容6.1.原理CHO工程细胞所表达的蛋白质产品，其外源性DNA残留量的测定采用荧光定量PCR法。该方法是以荧光定量PCR仪为设备平台基础，选择CHO细胞中含量较丰富的一段LTR（longtandem

3、repeat，长串联重复序列）为靶标序列设计扩增引物，建立基于Taqman探针的定量检测实验。用已知量的CHO细胞基因组DNA做标准曲线，通过对Ct值进行线性回归计算样品中DNA的含量。6.2.实验材料1.1.1.试药与试液1.1.1.1.灭菌水使用电阻率不低于18.2MΩ·cm的超纯水，121℃灭菌20分钟以上。本方法所有试液均用灭菌水配制。1.1.1.2.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH=8.0）称取60.57g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于400ml水中，用盐酸调节pH值到8.0，加水至500ml。室温保存。1.1.1.3.0.5mol/LEDTA溶液（pH=8.

4、0）称取93.06g乙二酸四乙酸二钠，溶于400ml水中，用氢氧化钠调节pH值到8.0，加水至500ml。室温保存。1.1.1.4.TE缓冲液量取1mol/LTris-HCl缓冲液5ml，0.5mol/LEDTA溶液1ml，加水至500ml。室温保存。1.1.1.5.NaCl溶液称取58.5gNaCl用适量水溶解后，加入1mol/LTris-HCl缓冲液（pH=8.0）4ml，并用水稀释至200ml。室温保存。1.1.1.6.DNA残留量检测样品处理试剂盒PrepSEQTMResidualDNASamplePreparationkit购自AppliedBiosystems，cat：

5、，根据试剂盒说明将各组分分别贮存于室温或冰箱。1.1.1.7.定量PCR预混溶液PremixExTagTM（ProbeqPCR）购自TaKaRacat：RR390A，每管启用前-20℃保存，启用后4℃保存，避免多次冻融。1.1.1.8.CHO-49引物探针探针引物序列如下：上游引物：TCgAggTTAAgAgCACCAACTg；下游引物：gATTgTTgTgAgCCACCATgTg；探针：CCAgAggTCCTgAgTTCAATTCCCAgC；引物混合物的配制：将上下游引物分别用TE缓冲液稀释至27μmol/L，等体积混合后分装，-20℃保存。探针的配制：用TE缓冲液稀释至10μm

6、ol/L后分装，-20℃保存。1.1.1.标准物质1.1.1.1.CHO细胞DNA国家标准品购买自中国食品药品检定研究院，分装后-20℃保存。1.1.2.仪器与用具荧光定量PCR仪、无菌1.5/2.0ml低吸附离心管（PCR级洁净）、离心机、洁净工作台、涡旋混合仪、水浴锅、移液器、防气溶胶带滤芯移液器吸头、磁力架（AppliedBiosystems）、荧光定量PCR反应管/板。1.2.操作步骤1.2.1.标准曲线稀释取已分装的CHO细胞DNA国家标准品，用TE缓冲液稀释到3×105pg/ml后，按下表分别进行10倍梯度稀释。Tube编号稀释方法DNA浓度(pg/ml)SD1/3×1

7、05SD250μlSD1+450μlTE3×104SD350μlSD2+450μlTE3×103SD450μlSD3+450μlTE300SD550μlSD4+450μlTE30SD650μlSD5+450μlTE31.1.1.样品处理根据各品种项下具体要求，进行样品处理；如需采用试剂盒对样品进行残留DNA提取，应按以下步骤进行：1.1.1.1.待测样品：根据各品种项下规定，取待测样品100μl或200μl于2.0ml的离心管，一般每批样品做三个平行。1.1.1.2.