最新实验二 脲酶的分离.doc

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1、__________________________________________________实验二脲酶的分离【实验目的】掌握凝胶层析分离纯化蛋白质的方法与原理【实验原理】凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之分子筛层析。其固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同；也就是蛋白质的大小不一，凝胶上有大小不一的孔；大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢；小的蛋白质则进入大小孔中，下来速度最慢。凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突

2、出优点：不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶的种类有很多，包括葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，株状琼脂糖凝胶等。根据实验目的的不同选择不同型号的凝胶。脲酶分子量较大，达480kDa。脲酶粗制品通过交联葡聚糖SephadexG－200层析柱进行分离。酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离

3、的目的。脲酶活性测定，根据脲酶催化尿素水解释放氨和CO2的反应：【实验操作】1.样品的制备称取1g刀豆粉，加入32%丙酮5ml，振摇10min，倒入离心管中，用1ml32%丙酮洗小三角烧瓶一次，也倒入离心管中，然后3000rpm离心5min。吸取上清液，加入4倍体积的冷丙酮，3000rpm离心5min。弃掉上清液，取沉淀，待沉淀中的丙酮蒸发后加入0.8mlH2O，即为我们的脲酶粗提液。2.装柱先向柱中加入少量水，留部分水于玻璃管中，关闭出口，检查是否通畅。摇匀三角瓶中的凝胶，自顶部将凝胶缓慢加入柱内，使凝胶上升，待底部凝

4、胶沉积到1~2cm时，打开出口，此间不能使胶面露出。然后调节凝胶床面上的水柱高度保持在10cm左右。3.加样、洗脱、收集首先将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流，达到床面将近露出为止，关紧出口。然后用吸管吸取0.6ml脲酶粗提液，缓慢地沿着层析柱内壁加于床表面，再用滴管小心加入1ml水，使之进入床面。接着开始洗脱，接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别收集在小离心管。控制流速3ml/15min，收集量3ml/管。4.检测1）蛋白质检测：①上样稀释液:脲酶粗提取液0.1ml+蒸馏水稀释20倍。②所有收集管编号。③280nm测

5、定光密度，乘以0.75为蛋白质含量(mg/ml)。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除__________________________________________________2）脲酶活性的检测：①酶促反应 空白洗脱液（各管编号）上样稀释液3%尿素（ml）0.50.50.50.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8（ml）1.01.01.037℃保温5min酶液（ml）-0.50.5无离子水（ml）0.5--37℃保温15分钟，保温结束，各管中立即加HCl0.6ml。②显色反应 空白洗脱液（各管编号）上样稀释液酶促反

6、应液（ml）0.50.05~0.50.05~0.10无离子水（ml）2.52.95~2.52.95~2.903%阿拉伯胶（滴）222充分混匀Nessler试剂（ml）0.750.750.75立即混匀，在分光光度计480nm波长比色测定其光密度。各管用量：A280酶促反应液（ml）<0.10.50.1~0.20.40.2~0.30.30.3~0.40.20.4~0.50.1>0.50.055.计算。根据测得的实验管的光密度，从标准曲线查得氨的微克分子数。雅尔塔电子科技创业计划书收集于网络，如有侵权请联系管理员删除_____

7、_____________________________________________一、项目介绍1．主要经营项目：计算机领域内的技术开发、技术转让、技术咨询、技术服务；电子产品的维修；电子产品及配件、电脑软硬件及设备、通讯设备、办公自动化设备、办公家具、五金交电、电线电缆、五金工具的销售。2．电子产品服务业市场分析：对于电子产品服务业没有统一的定义，对此，人们大都参考电信服务业的定义和分类。我们认为，电子产品服务业是指利用计算机、通信和网络等现代信息技术从事信息的生成、收集、处理加工、存储、传递、检索和利用，向社会

8、提供各种信息产品或服务，从而实现信息价值增益的行业集合体。全球电子产品服务业发展具有如下特点：产业规模逐渐增大，外包活动日趋活跃，服务内涵逐步延伸，商业模式推陈出新，服务平台不断拓展，企业竞相重组合并。全球电子产品服务业的市场格局：收集于网络，如有侵权请联系管理员删除