基因表达转录分析中内参基因的选择_张艳君

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1、TechniquesandMethods技术与方法生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2007,34(5):546~550www.pibb.ac.cn基因表达转录分析中内参基因的选择*张艳君1,2)朱志峰1)陆融1,3)徐琼1)石琳熙1)简序1)刘俊燕1)姚智1)**(1)天津医科大学免疫学教研室，天津300070；2)天津医科大学生物化学教研室，天津300070；3)深圳康哲药业有限公司，深圳518029)摘要目前基因表达的转录分析多采用单一看家基因作为内参来校正目标基因的表达量.实验中以人肝癌BEL-7402细胞为研究对象

2、，应用实时荧光定量PCR技术，观察了新型三肽化合物酪丝缬肽作用后RPL13A、UBC、EIF4A、B2M、GAPDH和ACTB共6个看家基因mRNA水平的表达情况.经过geNorm程序统计学分析处理，结果表明，这6个看家基因的表达存在差异，确定了RPL13A、UBC2个看家基因用于校正目标基因的表达量.基因表达转录分析中内参基因选择的必要性在实验中得以证明，更重要的是为各种实验因素影响下(尤其是新物质作用下)内参基因的选择介绍和提供了一种行之有效的方法.关键词内参基因，geNorm程序，基因表达，实时定量PCR学科分类号R331基因表达分析在生命科学的众多研究领域中变具有显著的抑制

3、作用[6].为了深入研究YSV的作用得日趋重要，其研究的深入将为探索疾病相关基机理，我们首先需要明确YSV对看家基因的影响因、了解基因表达调控的复杂网络、解析生命奥情况.本研究选择RPL13A、UBC、EIF4A、B2M、秘、最终为人类服务大有裨益.在转录水平进行基GAPDH和ACTB共6个看家基因，通过实时定量因表达定量的方法，如实时定量PCR、RNA印迹、PCR技术对YSV作用下BEL-7402细胞中各看家核糖核酸酶保护分析、基因芯片等，在蛋白质水平基因的转录水平进行检测，同时采用进行定量的方法如蛋白质印迹等，都需要应用内参Vandesompele等[4]编写的geNorm程序

4、对检测结果基因对目标基因表达量进行校正，以期获得真实可进行统计学处理，分析哪些看家基因适于YSV对靠的结果.看家基因有几百种，最常用的为ACTB、肿瘤基因表达水平影响的研究.GAPDH、18SrRNA、28SrRNA，理想的看家基因1材料和方法应在各种实验因素条件下，各种类型的组织或细胞[1].然而，大量的研究结果表明，任1.1中均恒定表达人肝癌BEL-7402细胞培养和总RNA提取何一种看家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型将人肝癌BEL-7402细胞经0.25%胰酶-0.02%的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定.在其EDTA消化后，用含10%FBS的RPMI-1640完全培

5、养基调整成5×104个/ml的单细胞悬液，每瓶他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，有4ml接种于25cm2细胞培养瓶中，37℃、5%CO时可以是十几倍、几十倍甚至是上百倍的2差异[2,3].盲目地使用一种看家基因作为内参，一方的细胞培养箱中培养24h后，实验组分别加入含面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论[4,5].本研究中的酪丝缬肽(tyroservatide，YSV)是一种新三肽化合物，化*国家高技术研究发展计划(863)(2004AA2Z3170，2005AA2Z3D40),学结构组成为L-酪氨酰-L-丝氨酰-L-缬氨酸，分国家重点基础

6、研究发展计划(2003CCA04300)和教育部重点项目(03007)资助.子结构式为C17H25N3O6，分子质量为367.40，先前**通讯联系人.Tel:022-23542817,E-mail:yaozhi@tmu.cn研究表明YSV对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤收稿日期：2006-09-08，接受日期：2006-11-182007;34(5)张艳君等:基因表达转录分析中内参基因的选择·547·不同浓度YSV的完全培养基(深圳康哲药业有限公7500SystemSoftware(AppliedBiosystems公司)得司生产，批号：200504)，使YSV的终浓度分别为

7、以运行.引物序列见表1，反应体系参照Realtime100mg/L、200mg/L，阴性对照组加入等体积的完PCRMasterMix(TOYOBO，JAPAN)说明书，简言全培养基，每个样本做3个平行对照.培养48h后之，每个PCR反应管内加入SyberGreenmix终止细胞培养，使用TRI试剂(MRC公司，USA)12.5μl、上下游引物(2.5μmol/L)各2μl、cDNA按说明书提取总RNA，采用无RNA酶的DNA酶工作液5μl和高压灭菌去离子水5.5μl，