酶的提取及纯化1学习资料.ppt

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1、酶的提取及纯化1防止酶的变性失活低温合适的pH避免激烈搅拌，减少泡沫去除重金属、微生物、蛋白酶等酶提取纯化总原则一、酶液的制备1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程收集细胞细胞破碎固液分离酶液浓缩酶液2、微生物胞外酶的酶液制备流程一、酶液的制备发酵液预处理固液分离酶液浓缩酶液3、细胞破壁的方法：干式：液态氮研磨,磨粉机,球磨机(ballmill)湿式：均质机,果汁机(Waringblender),Polytron,研砵,玻璃球(glassbead),超声波震荡,Frenchpress4、发酵液的预处理一、酶液的制备预处理的目的改善发酵液的过滤性能，使其更易过滤，获得澄清

2、的酶液。预处理的方法加热凝聚（Coagulation）和絮凝（Flocculation）助滤剂5、固液分离过滤离心沉降膜过滤一、酶液的制备6，酶液浓缩酶液浓缩的作用减少盐析剂、有机溶剂用量减少压滤后的废水量，从而减轻其对周围环境的污染酶液浓缩的方法真空浓缩（刮板薄膜蒸发器、降膜式蒸发器、升膜式蒸发器）冰冻浓缩超滤浓缩一、酶液的制备盐析沉淀有机溶剂沉淀等电点沉淀复合沉淀双水相萃取反相胶团萃取二、酶的提取1，盐析■盐对蛋白质溶解度的影响：●盐溶Salting-in:加盐使蛋白质溶入水溶液中●盐析Salting-out:加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來■提高盐浓度会增加蛋白质的溶

3、解度：分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入时，这些水分子被抽出，以便盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域相互结合，形成沉淀。机理破坏酶蛋白质分子表面水膜中和酶蛋白质分子表面电荷定义：在酶或蛋白质溶液中加入中性盐使其沉淀析出的过程盐析盐析法的优点成本低，不需要什么特别昂贵的设备。操作简单，安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。盐析法的缺点沉淀物中含有大量的盐析剂盐析用中性盐的选择常用的中性盐MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4选择中性盐应

4、注意的问题使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。对酶无毒性，应用不受影响。价格低廉。废水处理容易。常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：0℃20℃80℃100℃(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101几种盐在不同

5、温度下的溶解度（克/100毫升水）2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。4)价格便宜。盐析剂用量的确定盐浓度的表示法盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和的溶液成为100%饱和度。影响盐析的因素蛋白质浓度离子强度和类型pH温度蛋白质的浓度与盐析的关系利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋白质实际浓度有很大关系。LogC1＝β-KsI1这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。但如果这种蛋白质

6、在溶液中含量较低(设其浓度为C2)，则需要加人较多的中性盐，蛋白质才开始沉淀。(设此时离子强度为I2)应写作：LogC2＝β-KsI2Log（C1/C2）＝Ks（I2-I1）离子强度和类型对盐析的影响蛋白质在不同电解质中的盐析效应几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离子的强度离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱pH对盐析的影响盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处，才能使盐析获得更好效果。温度对盐析的影响温度升

7、高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。在一般情况下，蛋白质的盐析温度要求不严格，可以在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶，要求在低温0-4℃下操作。以避免活力的丧失。2，有机溶剂沉淀原理有机溶剂的沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数，溶液的介电常数减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加从而使溶解度减少。优点分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉淀不用脱盐，过滤比较容易。在生化制备中应用比盐析