选修一血红蛋白的提取和分离讲解学习.ppt

《选修一血红蛋白的提取和分离讲解学习.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、选修一血红蛋白的提取和分离②当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以。相对分子质量较小较长较慢较大凝胶外部较短较快分离2．缓冲溶液(1)作用在一定范围内，抵制外界的对溶液pH的影响，维持pH。(2)配制由1～2种溶解于水中配制而成，通过就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。酸和碱基本不变缓冲剂调节缓冲剂的比例3．电泳(1)概念指在电场的作用下发生的过程。(2)原理在一定的下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上或

2、，在电场的作用下，这些带电分子会向着的电极移动。带电粒子迁移pH正电负电与其所带电荷相反(3)作用电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中。(4)方法常用的电泳方法有和。测定蛋白质分子量时通常使用。带电性质大小形状迁移速度各种分子的分离琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳[思维激活1]凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同？提示凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小，形

3、状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。蛋白质分离的依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。(1)凝胶色谱法相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在外面垂直向下移动较快较短先从凝胶柱洗脱出来小小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒较慢较长后从凝胶柱洗脱出来(2)电泳法①含义：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理：一些生物大分子具有可解离的基团，在一定pH下，会带

4、上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。因各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，迁移速度不同，从而实现各种分子的分离。③常用方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在测定蛋白质的相对分子质量时，通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，此方法也可用来分离蛋白质混合组分(亚基)。【巩固1】凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是(　　)。A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小B．根据蛋白质相对分子质量的大小C．根据蛋白质所带电荷的多少D．根据蛋白质溶解度的大小解析凝胶色谱法所用的凝胶实际上是一些微小多孔的球体，在小球内部有许多贯穿的通道，

5、相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。答案B1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。2．样品处理(1)红细胞的洗涤采集血样，，吸取血浆后加洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是，以利于后续步骤的分离纯化。血红蛋白提取和分离的实验操作与评价样品处理粗分离纯化纯度鉴定低速短时间离心生理盐水除去杂质(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞依次加入至原血液体积、40%体积的，置于磁力搅拌器上搅拌10min，使红

6、细胞吸水，血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到中，以2000r/min的速度10min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。蒸馏水甲苯涨破离心管离心(4)透析取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的中(pH为7.0)，透析12h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。3．凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安装。(2)凝胶色谱柱的装填。(3)样品的。磷酸缓冲液色谱柱加入和洗脱4．操作提示(1)红细胞的洗涤、与十分重要。洗涤次数过少，无法除去；离心速度和

7、时间会使等一同沉淀，达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理商品凝胶使用前需直接放在中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶，加速膨胀。洗涤次数离心速度离心时间血浆蛋白过高过长白细胞洗脱液用沸水浴加热(3)凝胶色谱柱的装填在装填凝胶柱时，不得有存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的，降低分离效果。(4)蛋白质的分离如果，说明色谱柱制作成功。气泡洗脱次序红色区带均匀一致地移动[思维激活2]透析的目的是什么？依据了什么原理？提示透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质，透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过，不允许大分子