土壤微生物的分离和纯化实验.doc

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1、实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。二、原理在自然界中，土壤是微生物生活中的最适宜的环境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，因此，为了研究某一微生物的特性，或者要大量地培养和利用某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。从而获得某一菌株的纯培养。这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的

2、酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。四、方法(一)涂抹平板分离法1．制备土壤稀释液称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。2．倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％

3、乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。(见图18)。3．涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。4．培养将培养皿倒置，放在28℃温箱培养。5．移接将培养后长出的单个菌落分别移接到三种斜面培养基上，28℃下培养，待菌苔长

4、出后检查菌苔是否纯，若有其他杂菌，要进一步进行分离纯化，直到获得纯培养，整个分离过程(见图19)。图17接种工具图18倒平板图19从土壤分离微生物的操作过程(二)平板划线分离法1．倒平板：按上述三种培养基各倒一平板、冷凝。2．划线：右手拿接种环，从上述10-1的土壤悬液中取一环，左手托培养皿，并在火焰附近打开盖少许，在培养基平板表面轻轻划线，划线方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品进一步在平板上稀释分散，使形成单独的菌落。划线的方法（如图20），具体方法如下：(1)取一环菌样先在平板上划平行线至一半，然后将接种环上剩余菌烧死，培养皿转动90°角，通过第一次平行线划

5、线，划完后盖上皿盖，倒置培养。(2)取一环菌样后先在平板上作几条平行线，再将培养皿转动70°角。，把接种环上剩余的菌烧死，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行线，再用同法通过第二次平行线作第三次；第四次平行线。划完毕后，盖上皿盖，倒置培养。图20划线分离方法五、实验结果10^-5浓度细菌放线菌酵母菌霉菌PDA72132高氏一号1761NA42132六、思考与讨论1．3-5天后统计3种培养基平板上长出的菌落数，确定最佳稀释浓度。初步判别各培养基上长出的菌落属于分别哪个类群？简述它们的菌落形态特征。最佳的稀释浓度为10^-5培养基长出的菌落分为：放线菌，细菌，酵母菌，霉菌四大类。放线

6、菌的形态特征为干燥，小而紧密，颜色多样。细菌的特点是湿，小而突起或大而平坦。酵母菌的特点是较湿，菌落大而突起。霉菌的特点是干燥，菌落大。2．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？将接种环上多余的菌体烧掉是为了为了防止杂菌污染,提高培养纯度。划线分离的目的就是为了分理出单一的菌种，只有通过不断稀释划线才能够分离出，如果重叠的话就不能把单一的菌体从多种菌体中分离出来。3．培养时为什么要将培养皿倒置培养？①防止冷凝水滴下冲坏自然形成的菌落，影响观察。②拿出观察时方便，防止平皿底滑落。③防止杂菌落入。4.在倒完平板之后一定要等待一段时间，等培养基冷却下来，凝

7、固好之后再进行涂布平板以及划线，否则涂布平板以及划线的操作会把培养基弄破，影响最后的实验结果。5.涂布平板和划线时都要注意卫生，事先都要进行高温灭菌处理，否则会造成其他细菌的污染。6.刚开始倒平板的时候手可能会有些发抖，多练习几次就好很多了。