蛋白芯片技术的研究现状教程文件.ppt

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1、蛋白芯片技术的研究现状蛋白芯片技术的研究现状日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下，使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵

2、母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白，按每点为1纳升的点样量点样10799次，另一次用FRB（FK-BR12-rapamycinbindingdomainofFKBP-rapamycin-associated

3、protein）点样。为了确保不同分子量的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA，然后使用N，N'-二琥珀酰胺碳酸（N，N'-disuccinimidylcarbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油，以防止因汽体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将芯片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于

4、封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基（封闭）。为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBP12（12KdFK506-bindingprotein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析--为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。蛋白芯片的应用研究Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特

5、异抗体抗原成分，他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片，从中找出了4组高度特异性的抗原（蛋白）-抗体复合物，其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明，但是由于表达水平都较低，说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法，可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分，或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用，这将有助于对某些疾病（包括肿瘤）的发病分子机理的研究，以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理，可以将不同的抗体固定于载体上成为抗体蛋白芯片，用于检测不同组织产生的蛋白质。Ge在蛋白质的相互作用的研究中，采

6、用了一种通用的蛋白质芯片系统，该系统敏感有效，用途广泛，可定量测定及重复使用，而且操作简易。Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对激酶-作用物系统，即依赖3'，5'-磷酸蛋白激酶-Kemptide；蛋白激酶Ⅱ-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1，首先将各系统的作用物按顺序固定于三张BSA-NHS玻片上，分别在有同位素γ-33PATP的环境中，与不同蛋白激酶温浴，然后，玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究

7、及代谢机制的分析。Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺（即AP1497）等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质，研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片，将BSA分别用荧光物质（Alexa488、Cy3或Cy5）标记，并分与DIG、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探针，用每一种具有