第09章-疏水层析ppt课件.pptx

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1、第二部分分离技术生物活性分子的分离与表征第3章、沉淀法第4章、吸附层析第5章、纸层析第6章、凝胶过滤层析第7章、离子交换层析第8章、亲和层析第9章、疏水层析第9章疏水层析HydrophobicInteractionChromatography9.1、概述9.2、疏水层析原理9.3、疏水层析介质9.4、疏水层析实验技术9.5、疏水层析的应用9.6、反相层析9.1、概述疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的层析技术。从作用机制来看，它属于吸附层析

2、。非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应(Hydrophobiceffect)。疏水效应疏水作用(hydrophobicinteraction):非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集在一起的作用则称为疏水作用。对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学折衷的结果。

3、就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这部分暴露在外疏水性基团称为疏水补丁。疏水和亲水部件表面的溶菌酶。最疏水部分是深红色,浅红色的更少的疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的,更少的亲水部分是浅蓝色。高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。A)9.2、疏水层析原理B)亲水

4、性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobicpatch)；令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基；高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。一般在lmol／L(NH4)2SO4或2mol／LNaCl高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起。然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。也就是：疏水作用弱

5、(即亲水性强)的物质，用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来）对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。9.3、疏水层析介质HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多

6、为苯基。R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度（A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基偶联至基质的常见配基类型对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。常用商品化疏水层析介质1.ButylSepharose4FastFlow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的

7、生物分子。2.OctylSepharose4FastFlow工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。⒊PhenylSepharose6FastFlow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml40μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，一、层析柱的制备1、层析介质选择配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的

8、选择性、结合能力起到重要的作用。9.4、疏水层析实验技术配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度显著的参数。最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。图21在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。总的来说，疏水相互作用填料可以根据它