疏水作用层析

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1、第二部分药学生化实验实验一.疏水作用层析【实验目的】通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。【实验原理】疏水作用层析(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)是根据分了表血疏水性差别來分离蛋口质和多肽等生物大分子的--种较为常用的方法。蛋口质和多肽等生物人分子的表面常常暴露着一些疏水性棊团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以为疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分了由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作川层析就是依据这一原理分离纯化蛋口质和多肽等生物大分子的。疏水作

2、用层析的基木原理如图所示。P000OP:固相支持物L：疏水性配体S：蛋白质或多肽等生物大分了H：疏水补丁W：溶液中水分子溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子L疏水性层析介质Z间的疏水作用。利用这个性质，在高离了强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质匕然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下來，当离子强度降低吋，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。Phcnyl-Scpharosc™6FastFlow是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糊为支持物，交联琼脂糊支持物与苯基共价结合。苯基作为疏

3、水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。Phenyl-Sepharose™6FastFlow结构示意图如下。0HI—o-ch2—ch-ch2-o【实验材料】1.实验器材层析柱(1.6X20cm)；iH流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计2.实验试剂(1)疏水层析介质：Phenyl-Sepharose™6FastFlow(1)溶液A：0.1MNa2HPO4,pH7.0(2)溶液B：0.1MNa2HP04,pH7.0,1.7M(NH4)2SO4(3)蛋白质样品溶于溶液B【实验操作】1.层析介质准备：Phenyl-Sepharose™6FastFlow疏

4、水层析介质保存在20%乙醇屮，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。加入溶液A,溶液的体积约占总体积的1/4。2.装柱：将层析柱洗净，固定在铁架台上，层析柱下口用螺旋夹夹紧。加入溶液B,打开下II让溶液流出，排出残胡气泡，柱屮保留高度约2厘米的溶液。将准备好的层析介质轻轻搅匀，用玻璃棒引流，沿层析柱内壁将层析介质缓慢加进柱中。等到层析介质在柱中沉积鬲度超过1厘米时，打开下口。柱床高度达到6-8厘米时关闭下口，装柱尽可能一次装完,避免出现界面。3.柱平衡：用溶液B平衡1-2个床体积。注意始终保持层析介质处于溶液中，不要干柱。4.上样:収样品加入平衡好的层析柱，并收集层

5、析柱下口流出组分，调节流速为Iml/min,每管3mlc5.洗涤：用溶液B洗涤1个床体积，洗去上样不吸附组分。收集层析柱下口流出成分。6.洗脱与收集：梯度混合器左面装入250ml溶液A,右面装入250ml溶液B。按照100%-0%1.7M(NH4)2SO4梯度洗脱500ml,收集洗脱液。7.检测：取各收集管样品，280nm处测定紫外吸收。8.疏水层析介质清洗与保存：层析介质先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脱，最后川水洗至中性。处理好的层析介质放在20%乙醇中，4°C保存。【实验结果】以各个收集管的管号为横坐标，280nm处紫外吸收值为纵坐标作图，得到洗脱

6、曲线。分析实验结果并讨论。【思考题】疏水作用层析与反相层析有什么不同？Experiment13HydrophobicInteractionChromatography[Purpose]Tounderstandtheprincipleandmethodofhydrophobicinteractionchromatography・[Principle]HydrophobicInteractionChromatography(HIC)isaversatilemethodforthepurificationandseparationofbiomoleculesbas

7、edondifferencesintheirsurfacehydrophobicity.Proteinsandpeptidesusuallysequesterhydrophobicaminoacidsindomainsawayfromthesurfaceofthemolecule.However,manybiomoleculesconsideredhydrophilichavesufficienthydrophobicgroupsexposedtoallowinteractionwithhydrophobicligandsattachedtothechrom

8、atographicmatrix.Asshownin