微生物限度检查法教学提纲.ppt

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1、微生物限度检查法细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。因此

2、供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colonyformingunit，CFU），而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。微生物检验项目：细菌总数测定、霉菌与酵母菌总数测定、控制菌检验（包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄葡萄球菌、破伤风梭菌）以及活螨的检验。2.1设备2.1.1无菌室2设备、仪器及用具2.1.1.1结构和要求无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间

3、的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（２～２.5W/m3），紫外杀菌灯应距实验台面高度不超过1M，并应定期检查辐射强度，不得低于70μW.cm-2（１M距离）。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。2.1.1.2温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在18～26℃，

4、相对湿度40～60％。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于4.9Pa。2.1.1.3操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于是10000级，局部净化度为100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。2.1.1.4缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。2.1.1.5洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。洁净室（区）空气洁净度级别表洁净度级别尘粒最大允许数/立方

5、米≥0.5μm≥5μm百级3，5000万级350，0002，000十万级3，500，00020，000三十万级10，500，00060，000级别微生物最大允许数换气次数/小时浮游菌/立方米沉降菌/皿百级510.3米/秒万级100320十万级5001015三十万级—15---2.1.1.5.1浮游菌数测试方法（参照中人民共和国国家标准GB/T16293-1996）。2.1.1.5.2沉降菌数测定(Ⅱ法)无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个(经30～35℃预培

6、养48h，证明无菌落生长。)以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。无菌室操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。2.1.1.6消毒处理无菌室应在每次操作前、后均用０.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。2.1.2其他设

7、备、净化工作台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃），微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（3000～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。2.2仪器及器皿2.2.1菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或药物天平（感量0.1g），pH系列比色计。2.2.2玻璃器皿锥形瓶(250～300ml，内装玻璃珠若干)、研钵（陶瓷制，直径10～12cm）、培养皿(Ф9cm)、

8、量筒(100ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1)、注射器(20或是30ml)、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。2.3用具2.3.1大、小