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时间:2020-11-12
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1、单克隆抗体的制备方法动物的选择与免疫 1.动物的选择 纯种BALB/C小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2.免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1~50μ
2、g加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip(腹腔内注射)(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价) ↓2~3周 加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv(静脉内注射) ↓3天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途
3、径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 (2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5mlip ↓2~3周后 第二次免疫1×107/0.5mlip ↓3周后 加强免疫(融合前三天)1×107/0.5mlip或iv ↓ 取脾融合细胞融合 1.细胞融合前准备 (1)骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤
4、在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系名称来源耐受药物Ig链HLP3/X63-Ag8(X63)BALB/C骨髓瘤8-氮鸟嘌呤r1 KMOPC-21P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤--P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鸟嘌呤-K(不分泌型)P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)(X63×BALB/C脾细胞)杂交瘤8-氮鸟嘌呤--SP2/0-Ag14(SP2/0)(X63×BALB/C
5、脾细胞)杂交瘤8-氮鸟嘌呤--F0BALB/C骨髓瘤8-氮鸟嘌呤--S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-溴脱氧尿嘧啶核苷--MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-116-巯鸟嘌呤r2b K210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鸟嘌呤- KGM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巯鸟嘌呤r1 KU-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鸟嘌呤ε λ 骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞浓度以1
6、04~5×105/ml为宜,最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时,可按1:3~1:10的比例传代。每3~5天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理,使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 (2)饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中,许多环节 需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔
7、巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。 2.细胞融合的步骤 (1)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 与免疫小鼠相同品系的小鼠,常用BALB/C小鼠,6~10周↓ 拉颈处死,浸泡在75%酒精内,3~5min ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入5~6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管) ↓ 反复冲洗,吸出冲洗液 ↓ 冲洗液放入10ml离心管,1200rpm/分离5~6min
8、 ↓ 用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数至1×105/ml ↓ 加入96孔板,100μl/孔 ↓ 放入37。cCO2孵箱培养 (2)制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
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