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1、单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转
2、子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。方法
3、动物的选择与免疫1.动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。2.免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注
4、射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后 取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提
5、高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。初次免疫1×107/0.5mlip4G+X7↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv↓9取脾融合T细胞融合细胞融合前准备.骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。用于融合试验的主要骨髓
6、瘤细胞系名称来源耐药Ig链HLP3/X63-Ag8(X63),j:I7M)z*?#P'I6R!nBALB/C骨髓瘤MOPC-210h!f.{8y7
7、5Y A/Q E)K(H N3`8-氮鸟嘌呤9P'p.E,w(W3p)J-W8R"
8、r1 K/O9G-{+j%Y5J7F4pP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)"E1?5V&u;f6Y6R&L#V3O2iP3/X63-Ag86N/Q(J$w3`3h8~;B:Z$G8-氮鸟嘌呤'q"i-N5M.H ?(p$S;e9J－(O1v"Z3D&a6d!g V8
9、E－8r5Y9^:M2B" ~6QP3/NSI-1-Ag4-1(NS-1).Y+V+D;Z6p"N9@1d"T;c'yP3/X63-Ag83f#t;Q$b*n E3@/y+O"c8-氮鸟嘌呤*B6{6j9o ](h,S-H0W－K（不分泌型）7].L)O a&[6
10、/WP3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)+X0Y"e8~,m4s（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤 p;?+m7D+h.g9W!A5f2I8-氮鸟嘌呤8X5H#e!X%g3d(S#l－-o-m#`:N:M(z$h－$X(c/{:L+f5f5Q5_8
11、OSP2/0-Ag14(SP2/0)8-氮鸟嘌呤－8v7q1?5O-P+c2{（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤+s#W2w6U3O)q5k4V!n*^!T,] N;z/
12、)m"h5m&A9o+{"u5o－9M$w;l.r.g%^F0.^"Z.R#U$p,d$s,O3KBALB/C骨髓瘤0Q:y%y
