一植物病原真菌的分离培养及纯化技术说课讲解.ppt

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1、一植物病原真菌的分离培养及纯化技术201122）制作步骤马铃薯洗净，去皮称200g切块/条，1000ml水煮沸30min，用双层纱布滤去薯块，加入15-20g琼脂，加热熔化，再加20g葡萄糖，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，补水并定容到1000ml,分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。3自然pH；调pH值，也可用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。Tips:实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害

2、物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。42、植物组织和煎汁许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须灭菌后才能使用。53、培养基的分装根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分

3、装培养基时，容量不宜超过容积的1/3----1/2。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。6制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。4、灭菌高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/烘干、包装好，进行干热灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌化学灭菌、以及辐射灭菌等。7滤膜孔径主要有0.22µm和0.45µm两种。过滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全。

4、895、斜面、平板培养基的制作试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培养基。三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手

5、，并用70%酒精消毒。10二、真菌分离植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。11真菌的分离---就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。12观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而作出诊断。同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也

6、有可能是植物组织死亡后在上面生长的腐生性真菌。因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。（一）目的意义13分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行。（二）、真菌分离的程序1．分离前的准备工作141.1清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。为了保证无菌操作，应注意下面几点：1.2若限于条件实

7、验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。151.3分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5无菌操作前还要用70％酒精擦手；1.6工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。16分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器官或

8、组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。2．分离材料的选择17例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然，这类病害是比较少的。从受害的边缘部分分离这