第七章高通量基因组测序技术介绍ppt课件.ppt

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1、高通量测序应用与进展南京师范大学比较基因组学与生物信息学实验室纲要高通量测序简介高通量测序平台的介绍高通量测序的应用范围及案例分析相关生物信息学分析软件介绍高通量测序简介高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing3高通量测序流程文库扩增低通量ASanger测序B高通量测序并行测序高通量无需建立文库，两端加测序

2、接头PCR扩增高通量测序技术的起源与发展1992年LynxTherapeuticsMPSS2003年PolonySequencing（哈佛）2005年454Pyrosequencing2006年SolexaSequencing-by-Synthesis2007年ABISOLiD2008年HelicostSMSSequencing2010年IontorrentSemiconductorSequensing2011年PacificBiosciencesSMRTSequensing5LynxTherapeuticsMPSS极其复杂，没有商业化，2004年并入so

3、lexa。Polonyseq由哈佛GeorgeChurch实验室开发，使用连接测序，后来并入ABISOLiD平台。454焦磷酸测序由454LifeSciences开发，是第一个商业化高通量测序平台，后被Roche收购。Solexa在lynxMPSS的基础上简化开发了SequencingbySynthesis，后被Illumina收购。ABISOLiD在PolonySeq基础上开发了连接测序。Helicos是单分子测序，其特点是没有PCR扩增过程。2010的Iontorrent和其他的不同，不是以荧光进行检测信号高通量测序技术的传承关系图LynxMPSSSo

4、lexaABISOLiD454IonTorrentHelicosSMRTIlluminaSolexaRoche454PolonySeqABIIonTorrent现有主要高通量测序仪开发商测序仪品牌技术原理开发商Roche454焦磷酸测序RocheIlluminaSolexa边合成边测序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大规模并行连接测序ABIHelicos单分子荧光测序HelicosIonTorrent半导体测序ABISMRT单分子实时测序PacificBio454高通量测序法结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsionsystem）和焦磷酸测序的

5、方法,即一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术;在DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度,就可以达到实时测定DNA序列的目的。基本原理454测序原理基于磁珠的焦磷酸测序：A磁珠制备设备B454测序仪454测序流程将基因组打成较短的DNA片段，再将片段与接头相连，以使其更容易与磁珠结合在一起。将PCR产物包被于“油包水”的乳化剂中，每一滴乳化剂内除PCR产物外，还含有一个结合了一个DNA片段的磁珠，这样，PCR扩增过程就可以在每一滴乳化剂内独立

6、进行，而没有其它竞争性或者污染性序列的影响，使整个DNA片段进行平行扩增。454测序-DNA样品制备扩增反应完成后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板（一种光纤载板）的样品孔内供后继测序使用了。在光纤PicoTiterPlate板样品孔内还有测序过程所需的酶类及引物（引物与DNA片段末端的接头序列互补），当未经荧光标记的核苷酸流经过样品孔时，每次只允许一个互补dNTP接入，进行互补新链的合成。每当一个核苷酸连接到新链上时，就会释放一分子的焦磷酸盐（PP

7、i），而后PPi与相应底物反应形成1分子ATP，ATP再驱动荧光素酶转变为氧化荧光素酶，而氧化荧光素酶可以发出可见光，可被检测仪器捕获，形成峰图。该技术的序列阅读长度介于100到150个核苷酸之间。454测序-结果454的特点与主要应用读长较长，400－600bp通量较低，1Run1M序列，400－600Mb相对成本较高主要应用：denovo测序454高通量测序法优势该方法是一种结合了一种乳胶材料和皮升级反应孔的焦磷酸盐测序法。它一个典型的反应可以在4小时内测出2千5百万个碱基，其准确率可达到99％。利用Sanger毛细管电泳法测序平均每个小时可读6万7千

8、个碱基，平均准确率为99.4％。事实上，这种新的测序方法单个反应的