第三章细胞破碎与分离ppt课件.ppt

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1、第三章细胞破碎与分离3.1概述3.2细胞壁的结构及组成3.3细胞壁的破碎3.4细胞破碎技术的分类3.5包涵体的分离与蛋白质的复性3.1概述胞外产物霉菌产生糖化酶等胞内产物基因重组产品等分离纯化方法：⑴使用分泌性宿主，使胞内产物分泌到胞外⑵细胞破碎物理法，化学法，机械法，酶法不同类型的细胞分泌目标产物的类型：动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。植物细胞：多为胞内产物。微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。对于胞内

2、产物，首先必须将细胞破碎。3.2细胞壁的结构及组成细胞壁的化学组成：微生物的类型年龄生长生理学3.2细胞壁的结构及组成图3.1细胞外层结构3.2细胞壁的结构及组成3.3细胞壁的破碎破碎方法的选择：破碎目的待破碎生物体的类型破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；研究胞内产物在体内的功能，宜采用软处理。待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不同的敏感度3.3细胞壁的破碎细胞对破碎的敏感度注：上述数字表示相对敏感度，括号内数字不确切生物体的大小，形态，龄期，品系，生长条件，细胞壁结构，pH，温度以及细胞的变化也影响对破碎的

3、敏感度3.4细胞破碎技术的分类分类破碎原理破碎技术举例机械法固体剪切作用珠磨法、x-press法液体剪切作用高压匀浆、超声破碎非机械法溶胞作用酶溶法、物理法、化学法膜失水作用干燥处理几种细胞破碎方法的比较3.4.1破碎率的评价破碎率的定义：N0：原始细胞数N：经t时间操作后，保存下来的细胞数N0和N的获取：直接计数法（平板计数，显微镜计数）间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量）电导率测定法3.1x＝R/RmR:破碎后释放的化合物的量Rm:理论最大释放量电导率测定法：细胞破碎后，大量带电荷的物质被释放到水相，使电导率上

4、升，电导率随破碎率的增加呈线性增加。由于电导率与微生物的种类，处理条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解质含量有关，因此，正式测定应采用其它方法测定标准曲线。3.4.2破碎方法图3.4珠磨机简图㈠珠磨法生产厂商:瑞士WAB公司德国西门子机械公司形式：立式卧式（效率高）3.4.2破碎方法原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。㈠珠磨法珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为立式机中向上流动的液

5、体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化锆(密度为6.0g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充率为80％～85％。3.3.2破碎方法动力学方程：遵循一级动力学方程㈠珠磨法R：t时间内释放的蛋白质数量（mg/g）Rm：能释放的蛋白质最大数量，即100％破碎k：破碎的比速率其中：X＝R/Rm，破碎率3.4.2破碎方法影响破碎效率的因素：转盘外缘速度细胞浓度珠粒大小及装载量温度流速㈠珠磨法影响破碎效率的因素转盘外缘速度：在一定范围内，破碎的比速率与外缘速度成正

6、比㈠珠磨法该式有一定的适用范围，转盘外缘速度增加到一限定值后，蛋白质释放就不再增加图3.5搅拌速率与蛋白质释放的关系－70%珠体积；－80%珠体积；－85%珠体积影响破碎效率的因素转盘外缘速度增加虽然使细胞破碎增加，但产生的热量和消耗的功率也增加。破碎效率E被定义为：㈠珠磨法R：每Kg成品酵母释放的蛋白质数量q：物料通过量c：酵母的浓度P：5L珠磨机中，用于破碎所消耗的功率图3.6某一珠磨机下的效率在不同流量和搅拌速率影响破碎效率的因素细胞浓度：影响悬浮液的流变特性，从而影响蛋白质的释放，一般由实验确定一般控制在

7、40％左右，细胞湿重/体积㈠珠磨法影响破碎效率的因素珠粒大小及装载量：过少不，不易破碎过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高，不利搅拌，一般控制80％～90%.㈠珠磨法图3.7微珠直径对破碎率的影响对细菌，磨珠越小，破碎率越高；对酵母和藻类，存在最佳范围实验室：0.2mm工业：不小于0.4mm影响破碎效率的因素温度：热稳定性，目的产物不受破坏夹套冷却㈠珠磨法影响破碎效率的因素流量：㈠珠磨法图3.8流量对破碎速率常数的影响影响破碎效率的因素微生物类型：酵母较细菌在珠磨机中更易破碎，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞的十分

8、之一，在高速珠磨机中不易破碎。㈠珠磨法影响破碎效率的因素㈠珠磨法影响破碎效率的因素延长研磨时间，增加珠体装量，提高基本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率，使能耗加大。同时:1、产生较多热能，增加冷却控温的难度；2、大分子目的产物失活增加3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。因此,破碎率控制在80％以下。㈠珠磨法3.