流式细胞仪的原理与应用.ppt

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1、流式细胞仪的原理与应用TheprinciplesandapplicationsofFlowCytometry焦鹏1.流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。概述2.流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术,同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬

2、液,用计算机进行数据处理,从而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数,被誉为是细胞分析领域的“CT”。3.流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。4.流式细胞术是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进

3、的细胞定量分析技术。5.国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）综合型（又称大型机、分析型）除具备检测分析功能外,还具有高速细胞分选功能,多用于科学研究。6.流式细胞仪的原理与应用一　流式细胞仪的原理二　流式细胞仪在生物医学中的应用7.流式细胞仪（FlowCytometer)研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量1973年世界第一台商用流式细胞仪FACSI（Fluorescence

4、ActivatedCellSorter）1980年中国第一台流式细胞仪FACSII北师大生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域8.流式细胞仪的工作原理待测样品制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料对细胞（或表面抗原等）染色后放入上样管中，在清洁气体的压力下将待测样品压入流动室，与此同时，不含细胞的磷酸盐缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照在样品流上，被荧光染色的细胞在

5、激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。9.前向角散射，即FSC，与细胞直径成正相关，所以我们平时上机的时候，有时用FSC做阈值，排除碎片及其它颗粒，避免干扰。侧向角散射，即SSC，是指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒性质的信息这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。前向光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小。荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。10

6、.流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。11.12.鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包裹下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂

7、直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。13.液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱14.另外，通过选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FCM同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。15.应用范围凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。