流式细胞仪的基本原理及应用ppt课件.ppt

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1、流式细胞仪的基本原理及应用郭晓临概况1968年，StanfordUniversity研制成功第一台Flurescence-activatedcellsorter，FACS1973年，BD公司出品第一台商品化流式细胞仪流式细胞仪（FlowCytometer）是测量染色细胞荧光强度的细胞分析仪，是一种对单细胞进行高速分析和分选的新技术。特点：特异、灵敏、多参数、快速、客观等。概况广泛应用于基础研究和临床工作，包括细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药理学，遗传学、及临床检验学等，在各学科领域发挥着显著的重要作用。Bec

2、tonDickinson,BD公司Coulter公司流式细胞仪(FCM)的基本原理1.FCM系统结构液流系统:样本流、鞘液流光学系统:激光光源、荧光探测器、分光器、滤片分选系统数据处理系统:计算机工作站2.FCM工作原理流程：单细胞悬液荧光染料特异性染色的样本加入荧光染料细胞单列通过测量区1.散射光信号2.荧光信号分离、收集分析光信号细胞理化特性分析图激光激发上机样本样本3.光信号散射光信号前向散射光(FSC):细胞大小侧向散射光(SSC):细胞粒度荧光信号:FL1、FL2、FL3,可代表DNA、RNA、表面抗原、

3、受体、基因产物蛋白等.常见荧光的激发波长与发射波长FITCPEPI激发光波长发射波长525nm580nm620nm488nm流式细胞仪的应用一、细胞周期分析细胞周期G1期（gap1phase)：DNA合成前期（2N）S期（synthesisphase)：DNA合成期（2N-4N）G2期（gap2phase)：DNA合成后期（4N）M期（mitosisphase)：细胞分裂期（4N）FCM技术在细胞周期分析中的应用原理：在细胞周期内，DNA含量随各时相发生周期性变化。通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细

4、胞周期各时相的百分比，周期动力学参数及DNA异倍体。流式细胞仪的应用PI染色：DNA含量测定嵌入性荧光染料（嵌入DNARNA双螺旋碱基之间）发射光波620nm，为橙红色。不能进入活细胞膜。（膜打孔或固定-染活细胞）染色细胞DNA时，要用RNA酶处理细胞。PI最佳染色浓度为50ug/ml。FCM技术在细胞周期分析中的应FCM技术在细胞周期分析中的应用细胞周期各时相百分比的测定细胞周期各时相DNA含量的测定DNA指数DNAIndex（DI）DI=样品Go/G1期峰均道值/正常二倍体Go/G1期峰均道值FCM技术在细胞周

5、期分析中的应用FCM技术在细胞周期分析中的应用CV值：变异系数，评价仪器精度的重要指标。CV值越小越好，一般在2%-3%（荧光微球）正常二倍体直方图应小于8%CV值=半高峰宽/u分布均值对照：内标准，外标准SinglecolourDNAstainingBrdu染色：准确测量S期流式细胞仪的应用二、FCM在检测细胞凋亡中的应用PI染色AnnexinV检测TUNELAssay