基因工程操作流程2016ppt课件.ppt

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1、（一）原核细胞的基因结构（补）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子--一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子--也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区:非编码区:原核细胞的基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子（二）真核细胞的基因结构(补)编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶

2、结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1.2基因工程的基本操作程序目的基因——主要指编码蛋白质的结构基因,也可以是一些具有调控作用的因子。取

3、出DNA用限制酶切断DNA目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的获取基因文库的种类：基因组文库：含有一种生物所有的基因部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库）获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因基因文库（genelibrary）的概念：将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。组织或细胞染色体DNA限制性核

4、酸内切酶DNA片段重组DNA分子含重组分子的转化菌载体受体菌基因组文库存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。mRNA逆转录酶cDNA双链cDNA重组DNA分子载体含重组分子的转化菌受体菌用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。cDNA文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因

5、可以基因文库的作用：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获取所需的目的基因获取目的基因的根据：见课本P9PCR(polymerasechainreaction)——多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪原理：反应过程：1.变性：将反应系统加热至90℃-95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至55℃-60℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：将温度升至70℃

6、-75℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA呈指数形式扩增。反应体系：DNA双链复制模板DNA、特异性引物（与目的基因的起始段互补）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸（dNTP）及缓冲液前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物利用PCR技术扩增目的基因PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果四种脱氧核苷酸高温变性解旋酶催化体外复制细胞核内热

7、稳定的DNA聚合酶DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子模板、能量、酶DNA双链复制DNA合成仪过程：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成获取目的基因方法三：化学合成法小结:目的基因的获取：三种方法(1)从基因文库中获取适用于目的基因序列为未知的情况(2)利用PCR技术扩增适用于目的基因的序列为已知的情况(3)人工合成适用于目的基因不是很大且其序列是已知的基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子

8、、标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。2、基因表达载体的构建——基因工程的核心构建基因表达载体的目的：（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代（2）使目的基因能够表达和发挥作用常用的受体细胞动物、植物、微生物转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。3、目的基因导入受体细胞1）将目的基因导入植物细胞（受精卵或体细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法转化方法2）将目的基因导入动物